S. pombe, organisme modèle et modèle pédagogique. Aspects moléculaires


Mai 2002	Aspects moléculaires

Quelques données sur les macromolécules de S. pombe
Quelques mutations affectant le cycle cellulaire
Les protéines cdk

Quelques données sur les macromolécules de S. pombe

Une cellule haploïde de S. pombe contient en moyenne 33,8 fg d’ADN, 3 pg d’ARN et 10 pg de protéines.
Le génome haploïde comporte 13,8 millions de bases (Mb) réparties sur 3 chromosomes
(Chromosome I : 5,7 Mb ; chromosome II : 4,6 Mb ; chromosome III : 3,5 Mb).
Ceci correspond à une taille génétique totale de 2 100 centimorgans.
Environ 60 % du génome code des protéines (2 % chez l’homme).

Quelques mutations affectant le cycle cellulaire

Même s’ils ont été identifiés en premier lieu chez les levures, de nombreux gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire (notamment cdc : cell division cycle) sont communs à tous les eucaryotes. Des mutations de ces gènes chez les levures ont permis d’expliquer les mécanismes fondamentaux qui en assurent le bon déroulement même si l’on est encore loin de comprendre tous les mécanismes impliqués. Certaines mutations qui perturbent le bon déroulement du cycle se traduisent phénotypiquement, par exemple par une différence de taille des cellules, ce qui permet d’identifier les mutants. L’existence de mutations thermosensibles (qui ne s’expriment qu’à une température donnée) est également un atout. Des mutations létales peuvent être ainsi conservées tout en ayant la possibilité d’étudier leurs effets phénotypiques.
Les mutations qui retardent ou empêchent la division allongent le cycle cellulaire sans affecter la croissance et se traduisent par une taille des cellules plus grande que la normale. Il en est ainsi de certaines mutations affectant le gène cdc2 comme cdc2-33 qui bloque un signal nécessaire à la transition G2-M. En outre, cette mutation est conditionnelle et ne s’exprime qu’à la température restrictive (> 35°C). Elle est de plus récessive. Inversement, les mutations qui accélèrent le cycle et aboutissent à une division prématurée se traduisent par une taille des cellules diminuée. Ainsi, une autre mutation du gène cdc2, cdc2-3w, se traduit par de petites cellules parce que le signal d’entrée en mitose est prématuré. Il s’agit d’un allèle dominant. Ainsi, des modifications légèrement différentes de la protéine conduisent à des effets opposés se traduisant par des phénotypes différents observables au microscope. Les clichés ci-dessous montrent l’effet phénotypique de ces deux mutations. À gauche, des cellules cdc2-33 thermosensibles, cultivées à 38°C, au centre les mêmes cellules cultivées à 20°C et à droite des cellules cdc2-3w de phénotype wee (« petit » en Écossais).

cellules aberrantes
(cdc2-33 cultivées à 38°C)

phénotype normal
(cdc2-33 cultivées à 20°C)

phénotype wee
(cdc2-3w)

Différents phénotypes chez S. pombe
(observation vitale, x 600)

Les protéines cdk

Le gène cdc2 de S. pombe, dont les homologues chez les autres espèces sont appelés désormais cdk1, code une protéine kinase cycline-dépendante (cyclin dependant kinase), petite protéine de 34 kd qui intervient à différentes moments du cycle cellulaire. Chez les métazoaires comme la drosophile, le xénope et l’homme, la protéine cdk1 est indispensable à l’entrée en mitose et au passage à la phase S de la mitose. Chez S. pombe, elle est impliquée dans le déclenchement du démarrage du cycle en G1 ainsi que dans la transition G2-M.
Comme leur nom l’indique, ces protéines ne sont actives que si elles sont combinées à une autre protéine appelée cycline. On connaît différentes cyclines, dont la concentration varie régulièrement au cours du cycle en fonction du rapport entre leur transcription et leur dégradation protéolytique ubiquitine-dépendante. Des cyclines différentes s’associent à la même kinase à des moments différents du cycle.
La fonction générale des protéines cdk consiste à utiliser l’ATP pour modifier par phosphorylation l’activité de protéines cibles indispensables au bon déroulement du cycle. Ces kinases sont elles mêmes régulées de façon comparable par phosphorylation et déphosphorylation assurées par d’autres kinases et phosphatases selon des voies régulatrices complexes. Le schéma ci-dessous présente ainsi la séquence d’activation simplifiée de la p34cdc2 qui constitue notamment un signal d’entrée en mitose chez S. pombe associée à la cycline B codée par le gène cdc13. Des mutations différentes du gène cdc2 peuvent avoir des effets opposés selon les fonctions affectées dans la protéine.

Activation de la protéine cdk1 au cours du cycle cellulaire de S. pombe

La structure tridimensionnelle de la protéine p34cdc2 de S. pombe n’a pas été établie, mais celle de la cdk2 humaine (298 acides aminés), très similaire, a été établie par radiocristallographie X et peut servir de prototype. Elle est représentée ci-dessous non liée à une cycline à gauche en image statique et, si on dispose du plug-in Chime, en modèle moléculaire interactif à droite..


Structure tridimensionnelle de la protéine cdk2 humaine (représentation en rubans)	Modélisation dynamique de la protéine cdk2 humaine (si Chime est installé sur votre ordinateur) Les commandes sont accessibles par le bouton droit de la souris.

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Le gène cdk1 s’est remarquablement conservé au cours de l’évolution au point qu’il est possible de le remplacer chez la levure par son homologue humain. Les protéines cdk comportent toutes environ 300 acides aminés (297 pour cdk1 de S. pombe, D. melanogaster et H. sapiens) et possèdent de nombreuses similitudes de séquence et une structure tertiaire similaire. Les protéines cibles sont elles aussi hautement conservées et sont phosphorylées par cdk1 au niveau d’un site bien défini dont la séquence consensus est de la forme : S/T*-P-X-K/R (S/T* : sérine ou thréonine phosphate ; P : proline ; X : tout aminoacide ; K/R : lysine ou arginine).
La protéine cdk1 a une forme grossièrement allongée et mesure environ 6 nm de long sur 4 nm de large. Elle comporte deux régions principales. La région N-terminale, en haut, est formée principalement de feuillets bêta (en vert) et d’une hélice alpha large (en rouge) qualifiée de PSTAIRE en raison de sa séquence d’acides aminés strictement conservée dans les différentes protéines cdk. PSTAIRE correspond à la séquence de l’hélice représentée avec le code à une lettre des acides aminés (proline-sérine-thréonine-alanine-isoleucine-arginine-acide glutamique). La région C-terminale, en bas, est plus volumineuse. Elle est formée principalement par 5 hélices alpha (en rouge). L’ATP (non représenté), substrat servant à la phosphorylation des protéines cibles, se place dans la fente délimitée par les deux régions principales mais l’entrée de la fente est bloquée par une boucle dite T. La phosphorylation sur la thréonine 14 et sur la tyrosine 15 inactive la protéine tandis que la phosphorylation de la thréonine 160 est nécessaire à son activité. Les événements de phosphorylation-déphosphorylation modifient la conformation de la protéine, notamment la position de l’hélice PSTAIRE et de la boucle T par rapport à l’ouverture de la fente où se trouve le site actif. Le modèle ci-dessous montre la structure générale de la molécule représentée en rubans. Pour souligner les sous structures essentielles aux fonctions de cette protéine, l’hélice PSTAIRE, les trois sites de phosphorylation et la boucle T on été représentées différemment du reste de la molécule avec Rasmol (voir légende).

Modèle tridimensionnel annoté de la protéine cdk2 humaine Le squelette carboné est représenté en rubans avec les hélices alpha en rouge, les feuillets bêta en vert et le reste en gris. Les sites de phosphorylation responsables de l’inactivation (thr14 et tyr15) sont représentés en boules et bâtonnets tandis que le site de phosphorylation responsable de l’activation (thr160) est représenté en sphères. L’hélice alpha1 PSTAIRE est représentée en bâtons et la boucle d’activation T en squelette carboné.

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