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ÉLECTROPHORÈSE
D'ADN SUR GEL D'AGAROSE
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La meilleure méthode
de coloration alternative de l'ADN
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Une méthode particulièrement
efficace et bon marché
L’électrophorèse en général, en particulier
l’électrophorèse d’ADN sur gel d’agarose, est une des techniques
de base aussi bien dans la recherche en biologie moléculaire que
dans les applications biotechnologiques. L’électrophorèse
de protéines sur gel d’agarose ou sur acétate de cellulose
ne présente guère d’obstacle technique et est couramment
mise en œuvre dans les établissements d’enseignement, notamment
au lycée, pour identifier et comparer des protéines. L’électrophorèse
d’ADN sur gel d’agarose permet d’aborder de manière concrète
les fondamentaux de la biologie moléculaire car c’est un outil indispensable
à la résolution de problèmes divers dans des domaines
variés (phénotype et génotype, médecine,
OGM, police scientifique, agroalimentaire). Elle est moins répandue
comme outil pédagogique car elle nécessite typiquement l’utilisation
de bromure d’éthidium, substance hautement toxique à déconseiller
dans l’enseignement, et un illuminateur UV, matériel coûteux.
Toutefois des méthodes de coloration alternative ont été
proposées, notamment par le bleu de méthylène
ou mieux par l’azure A, permettant d’éviter
le recours au bromure d’éthidium et aux UV mais ne donnant pas satisfaction
à tout le monde en raison de leur sensibilité moins bonne
et de la coloration de fond parfois difficile à éliminer.
La méthode présentée ci-dessous est non seulement
plus sensible que les précédentes méthodes alternatives
mais, en outre, la coloration de fond est nettement moins intense et elle
est facile à éliminer simplement à l’eau distillée.
Enfin, le coût du colorant utilisé reste très modéré
(de l’ordre de 2 Euros par gramme alors que quelques mg suffisent pour
de nombreux gels).
Les clichés montrent deux gels d'agarose avant et après
décoloration et éventuel traitement numérique pour
en améliorer la lisibilité.
La signification des différentes bandes est indiquée
ci-dessous.
 
Durée de coloration : 15 h
Gels après coloration par le bleu de Nile
Un traitement numérique des images fait apparaître les
bandes d'ADN en négatif facilitant leur visualisation.
 
Après 1 h de coloration
(cliché numérique sur table lumineuse)
Après décoloration dans l'eau distillée
(Cliché numérique sur table lumineuse. Face supérieure
des gels)
Après décoloration dans l'eau distillée
(Image obtenue par scanner. Face inférieure des gels)
Après décoloration
(Traitement numérique de l'image pour obtenir l'effet négatif)
Informations techniques
Gel d'agarose à 0,8 % dans tampon TBE, pH 8,2
Gel gauche :
1 : ADN de phage lambda digéré par HindIII (2 µg)
2 : ADN de phage lambda digéré par EcoRI + HindIII (2
µg)
3 : ADN de phage lambda - pUC Mix* (4 µg)
4 : ADN génomique de lentille extrait grossièrement (quantité
inconnue)
Gel droit :
1 : ADN de phage lambda - pUC Mix* (4 µg)
2 : ADN de phage lambda digéré par EcoRI + HindIII (2
µg)
3 : ADN de phage lambda digéré par HindIII (2 µg)
4 : ADN de phage lambda digéré par EcoRI (1 µg)
* pUC Mix Marker : ADN de phage lambda digéré entièrement
par Eco130I et Eco81I plus ADN du plasmide pUCGK57 entièrement digéré
par HindIII.
L'hydrolysat donne théoriquement 14 fragments d'ADN dont
la taille s'échelonne de 74 à 19329 paires de bases (bp)
:
19329, 7743, 5526, 4254, 3281, 2690, 2322, 1882, 1489, 1150, 925, 697,
421, 74 (invisible).
Il peut s'établir une ligation entre fragments de 19329 bp
et 4254 aboutissant à une bande de 23583 bp.
Les échantillons d'ADN, lorsqu'il est extrait selon une méthode
grossière, montrent constamment une bande intensément
colorée, de faible poids moléculaire, qui migre en avant
du "smear". Le smear est une bande continue occupant toute
la piste d'électrophorèse et qui reflète la diversité
de taille des fragments obtenus lors de l'extraction de l'ADN génomique,
en raison de la fragilité des molécules d'ADN. Un smear est
visible sur le gel placé à gauche dans les clichés
ci-dessus et dans les trois bandes de droite du cliché ci-dessous.
La bande intensément colorée en avant du smear est
interprétée habituellement comme de l'ARN (l'ADN génomique
du commerce n'en présente pas car il est parfaitement purifié).
Pour vérifier cette hypothèse, de l'ADN génomique
de lentille extrait selon la technique la plus simple a été
soumis à l'électrophorèse. Un puits a reçu
de l'ADN de lentille extrait grossièrement et un autre puits a reçu
le même extrait de lentille traité par la RNase A pendant
30 min, traitement qui détruit les ARN. De l'ADN génomique
du commerce (thymus de veau) et des marqueurs de taille ont été
soumis à l'électrophorèse en parallèle avec
l'ADN extrait des lentilles. La photo ci-dessous présente le résultat
obtenu.
Gel d'agarose coloré par le bleu de Nile
1. Marqueurs de taille (ADN de phage lambda digéré par
EcoRI et HindIII : Promega)
2. ADN génomique de thymus de veau (Sigma)
3. ADN de lentille extrait grossièrement puis traité
par la RNAse A.
4. ADN de lentille extrait grossièrement, non traité
La disparition de la bande après traitement par la RNase A confirme
qu'il s'agit bien d'ARN. Ainsi, la méthode d'extraction particulièrement
simple employée pour obtenir l'ADN génomique, ne permet pas
de distinguer ADN et ARN.
Coloration de l’ADN par le bleu
de Nile
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Solution stock (concentrée 100 fois) à conserver au réfrigérateur
: dissoudre 10 mg de bleu de Nile dans 5 mL d’eau distillée.
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Solution de travail : 1 mL de la solution stock dans 100 mL d’eau distillée.
Selon la taille de la cuve de coloration, il faut de 100 à 300 mL
de la solution de travail.
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Placer le gel dans la solution de travail et le laisser se colorer pendant
1 h à 2 h.
Les bandes d’ADN apparaissent en bleu foncé sur un fond bleu
clair et peuvent être observées et photographiées dès
ce stade (voir cliché).
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Il est possible de laisser le gel dans le colorant pendant une nuit à
température ambiante sans altération des résultats.
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Si l’on désire décolorer le fond, mettre le gel à
tremper dans l’eau distillée et changer deux fois le bain de rinçage.
La coloration des bandes se conserve pendant quelques mois si le
gel est conservé, après coloration, dans un récipient
étanche contenant quelques mL d’eau distillée de façon
à ce que le gel ne soit pas immergé. Attention, il devient
alors plus fragile.
Fournisseur ADN :
PROMEGA distribué par EUROMEDEX
Fournisseur bleu de Nile :
Nile blue, SIGMA
Réf H 5632
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