RETOUR AU SOMMAIRE
ETUDE DE LA SYNAPSE NEURO-MUSCULAIRE
ACETYLCHOLINE. Retour aux articles



    On voudra bien excuser la piètre qualité de certaines des figures originales de l'article récupérées au scanner.
    D'autres résultats de meilleure qualité graphique ont été ajoutés.

    Introduction

    Le concept de synapse introduit en 1906 par Sherrington dans son ouvrage Action intégrative du système nerveux est l'un des plus féconds qu'ait connu la biologie au cours du dernier siècle. Il occupe, à juste titre, une place importante dans les programmes des classes terminales, mais est le plus souvent abordé de façon assez théorique en dehors des documents ultrastructuraux désormais classiques.

    Pourtant, il est possible de réaliser de nombreuses manipulations permettant une approche plus pratique des notions de neuromédiateur, récepteur, canaux ioniques etc.

    Dans le passé, on utilisait volontiers le rectus, principal muscle de la paroi abdominale de la Grenouille ou encore des fragments de Sangsue. En 1986, un article publié dans le bulletin de l'APBG (volume 4, 1986 pp 745-750 ) exposait le même type d'étude sur la musculature dorsale du Lombric. Cet animal se prête d'autant mieux à l'expérience que l'usage des Grenouilles nous est désormais interdit.

    Il s'agit d'un matériel facile à se procurer et que l'on peut garder très longtemps en élevage. Il peut d'ailleurs servir à bien d'autres manipulations.

    Si l'on ne dispose pas de matériel informatique, les manipulations proposées par P. Guibault et son équipe restent tout à fait intéressantes et sont une bonne occasion d'utiliser le matériel de myographie qui depuis le décret du 19 Octobre 1987 reste, le plus souvent, au fond d'un placard du laboratoire.

    Si on dispose d'une interface d'acquisition et d'un ordinateur, le même type d'expériences peut être réalisé avec profit et le traitement des résultats facilite grandement les interprétations.



    1- Protocole expérimental

    1-1 Le capteur

    Il a été réalisé en s'inspirant du matériel fabriqué et utilisé à Paris VI, au laboratoire d'EXAO (Département de formation des maîtres, Physiologie animale), pour l'étude de la contraction musculaire du gastrocnémien de Grenouille. Pour ceux qui voudraient le construire eux-mêmes, le plan est accessible en cliquant ici : plan de construction à l'échelle 1:1.
    Le montage une fois réalisé présente l'aspect suivant (vue d'ensemble et détails):

    <>Comme le montre la figure, toute contraction du muscle est traduite en un déplacement proportionnel d'une lame de cuivre dans une cuve remplie d'une solution de sulfate de cuivre dans la glycérine. Le schéma électrique indique que cette lame constitue le point milieu entre deux résistances appartenant à un pont : tout déplacement engendrera donc une variation de la tension électrique entre les deux bornes de mesure du pont. Le choix des valeurs permet d'obtenir une tension qui varie linéairement entre 0 et 5 volts selon l'amplitude du déplacement. On a ainsi une tension électrique proportionnelle au raccourcissement musculaire.

    Me contacter pour tout détail technique supplémentaire.

    La cuve de survie du muscle est constituée d'une seringue jetable de 20 mL modifiée selon les indications de la figure 1.

    1-2 Le système d'acquisition

    La prise de mesures peut se faire avec n'importe quelle interface disposant d'un logiciel généraliste et a été effectivement réalisée sur les interfaces "Botens", "Candibus" et "Orphy-GTS" et la plupart des résultats présentés obtenus avec cette dernière. Celle-ci accepte des tensions de 0 à +5 volts et peut être gérée par le logiciel généraliste, "Régressi". On peut ainsi choisir le nombre de mesures, leur durée etc. et réaliser de nombreux traitements sur les résultats obtenus. Le logiciel est d'un usage assez simple même pour les collègues peu férus d'informatique.

    Signalons toutefois que les mêmes manipulations peuvent être visualisées sur un oscilloscope, voire sur un simple voltmètre, mais il faudra alors faire les traitements à la main...

    1-3 Conditions expérimentales

    <>On choisira de gros vers de terre, plus faciles à disséquer et donnant une réponse plus ample. Cependant, j'ai obtenu également de très bons résultats avec des fragments de 15 mm de long seulement : seule la dissection est un peu plus délicate et requiert des ciseaux très fins. 
    Après avoir sectionné la tête et la queue, on découpe la paroi du corps de part et d'autre de la ligne ventrale médiane de façon à éliminer totalement la chaîne nerveuse ventrale et on enlève tout ce qui reste des organes internes en "gratouillant" avec le dos d'une pince courbe. Il est impératif d'enlever la chaîne nerveuse, faute de quoi on sera gêné par des contractions spontanées qui peuvent masquer les réponses aux traitements appliqués. Un fragment sans déchirure est alors fixé dans la cuve grâce aux serre-fines (voir figure 1). Il est bon qu'il soit entièrement immergé dans le liquide physiologique où on le laissera pendant au moins une demi-heure avant d'entreprendre les manipulations. Il est même possible de conserver vivant et réactif le fragment de muscle pendant une nuit entière à condition que le liquide de survie soit bien aéré.

    Pour vérifier les propriétés contractiles du muscle avant de commencer les expériences, on provoquera un réflexe d'étirement en donnant un coup sec de bas en haut sur le levier : le muscle doit répondre par une contraction franche.


    1-4 Produits chimiques et conditions d'application

    On prépare à l'avance les solutions suivantes :

    - solution physiologique (sol A)

    Dissoudre successivement dans un peu moins d'un litre d'eau distillée et dans cet ordre :

    • Chlorure de sodium...........................8.2 g
    • Chlorure de potassium.......................0.2 g
    • Chlorure de magnésium......................0.1 g
    • Hydrogénocarbonate de sodium.........0.2 g
    • Glucose.............................................1 g
    • Chlorure de calcium............................0.2 g
    • Compléter à un litre.

    - solution physiologique sans sodium (sol B) : on réalise une solution ayant pour base la formule de Hanks en supprimant le NaCl et l'hydrogénocarbonate de sodium. On augmentera le potentiel osmotique en ajoutant 40 g de saccharose par litre. En fait, j'ai essayé diverses solutions sans sodium. La principale difficulté est d'obtenir une pression osmotique convenable sans que l'excès de potassium et de calcium soit trop marqué, mais les muscles de Lombric sont osmotolérants, au moins pour une durée pas trop longue, et acceptent des milieux ne contenant que 200 mosmol.L-1.

    • Solution physiologique sans calcium (sol C) : solution de Ringer sans chlorure de calcium.

    Toutes les solutions précédentes recevront 1 mg.L-1 de néostigmine ("prostigmine" Roche, analogue synthétique de l'ésérine). Les résultats sont en effet plus durables et plus constants avec cet artifice. Il est néanmoins possible de faire des observations intéressantes sans néostigmine mais leur analyse quantitative est délicate.

    - solution mère d'acétylcholine : 1 ampoule de chlorure d'acétylcholine (0.2 g dans 1 mL) diluée dans 99 mL de solution physiologique soit 10 nmol.µL-1. Prendre une goutte de cette solution avec une pipette pasteur (330 nanomol par goutte) et la diluer dans 1 mL de liquide physiologique. C'est la solution D. Désormais, une goutte de cette solution contient 10 nmol d'acétylcholine et on peut en refaire autant qu'on veut à partir de la solution mère. Celle-ci n'étant pas excessivement diluée, on pourra aussi obtenir des concentrations plus élevées que celle de la solution D.

    - solution mère de curare (sol E) : 0.2 mL de "norcuron" dans 100 mL de solution physiologique. Ce produit ne se trouve pas dans le commerce et il faut donc s'adresser à un médecin hospitalier pour l'obtenir (différents curarisants sont utilisés en anesthésiologie). En revanche, on peut se procurer de la tubocurarine ou un autre curarisant auprès des fournisseurs spécialisés.

    La cuve, remplie de solution physiologique (20 mL) et alimentée en air par le bulleur d'aquarium a donc reçu le fragment de ver qu'on a laissé s'adapter au moins une demi-heure voire plus.



    2- Expériences et résultats

    2-1 Manipulations préliminaires

    Il convient de déterminer le meilleur réglage pour la suite des expériences. A cet effet, on tend le fragment musculaire en faisant glisser la cuve de survie dans sa pince de façon à ce que le contact du capteur soit légèrement décollé de sa position de repos. On règle alors, avec le bouton du potentiomètre, la tension électrique du capteur à une valeur de référence (je choisis 0.5 v pour qu'en cas de relaxation la courbe ne descende pas sous zéro).

    A l'aide d'une pipette Pasteur munie d'une petite poire, on laisse tomber dans la cuve trois gouttes de solution D. Ceci correspond à environ 30 nmol d'acétylcholine. En fonction du résultat obtenu, on tendra un peu plus le fragment ou on déplacera l'anneau de fixation sur le balancier de façon à obtenir une variation de tension électrique significative. La dose de 30 nmol (diluée dans les 20 mL que contient la cuve) doit déclencher une contraction importante du muscle (figure 2). Sur la figure 2, on remarque la déflexion traduisant le raccourcissement musculaire sous l'action de l'acétylcholine. Le tracé inférieur indique la durée du dépôt du neurotransmetteur.

    Cliquer sur l'image pour l'agrandir

    Selon la dimension du muscle, on pourra ajuster la dose d'acétylcholine, mais les variations d'un échantillon à l'autre restent assez limitées.

    On peut alors se livrer à diverses expériences :



    2-2 Recherche du seuil de sensibilité au médiateur

    Par des dilutions adéquates de la solution D, on commencera par des doses de 1 à 10 nmol sans oublier de rincer entre chaque expérience en vidant la cuve : il est préférable de rincer deux fois et d'attendre le retour du muscle à sa position de repos pour ne pas avoir à régler de nouveau le zéro.

    On obtient, en général, une contraction significative pour une dose de 1 à 10 nmol dans la cuve soit une concentration de 50 à 500 nmol.L-1 (Voir figure 3).

    On peut alors étudier l'effet de concentrations croissantes d'acétylcholine.



    2-3 Courbe dose/réponse

    En augmentant progressivement les doses d'acétylcholine, sans oublier de rinçer entre chaque prise de mesure et d'attendre le retour à la ligne de base, on obtient les courbes de la figure 4.

    Voir d'autres résultats (meilleure qualité graphique)

    Comme on le constate, l'amplitude de la réponse dépend de la quantité de neurotransmetteur déposé dans la cuve. On peut alors éventuellement construire la courbe V = f (log[ACh]) pour laquelle je renvoie à l'excellent article cité ci-dessus : les résultats que j'obtiens sont en effet tout à fait conformes à ceux présentés par M. Guibault.

    Voir le tracé V = f (log [ACh])

    A partir de l'étude de ces résultats, on illustrera la notion de complexe neurotransmetteur-récepteur (seuil, effet-dose, saturation).

    La notion de récepteur pourra être approfondie par l'étude de l'action du curare.



    2-4 Action d'un curarisant compétitif

    Il faudra commencer par déterminer la dose seuil qui diminue le tonus musculaire. Celle-ci est de l'ordre de 0.1 µg pour le norcuron mais peut varier notablement selon le curarisant utilisé.

    On pourra alors mettre en compétition des doses croissantes de curare avec une dose-test d'acétylcholine ou l'inverse. La figure 5 montre l'effet d'un tel traitement par comparaison avec l'effet d'une dose-test appliquée seule et qu'on a placé sur le même graphe.

    Cliquer sur l'image pour l'agrandir

    Ces résultats illustrent la notion d'inhibition compétitive pour les sites récepteurs.



    2-5 Effets de la concentration en cations

    Pour illustrer la notion de canaux ioniques, il est possible de réaliser le même type de manipulation dans un milieu sans sodium.

    Pour cela, on rince la préparation avec le milieu sans sodium (solution B) et on dépose une dose-test d'acétylcholine. La figure 6 permet de comparer l'effet de la dose test dans un milieu normal avec celui obtenu dans la solution B.

    Aucune contraction ne se produit dans ce milieu montrant ainsi le rôle des canaux sodiques chimio-dépendants dans le déclenchement de la contraction.

    En complément, on recommence la même manipulation, mais en cours d'expérience on injecte 5 mL de solution de NaCl à 0.9 %. Le résultat obtenu est visible également sur la figure 6 : dés que du sodium est ajouté au milieu, la contraction redevient possible.

    La même expérience a été menée dans un milieu dépourvu de calcium : si on ne souhaite pas préparer un milieu spécifique, on peut vraisemblablement utiliser un chélateur du calcium, mais je ne l'ai pas testé.

    La figure 7 A présente sur le même graphe les résultats obtenus avec une dose-test d'acétylcholine dans un milieu normal ainsi que dans un milieu sans calcium après deux rinçages successifs et la même dose-test d'acétylcholine.

    La figure 7 B montre comment le muscle "récupère" lorsque l'on rajoute du calcium.

    L'absence de calcium extracellulaire n'abolit pas entièrement la réponse au premier test alors que la seconde application ne provoque plus de réponse : on sait que le couplage excitation/contraction dépend universellement du calcium, mais il peut revêtir trois modalités différentes. soit une dépendance exclusive à l'égard du calcium intracellulaire (cas le plus général chez les vertébrés), soit une dépendance exclusive vis à vis du calcium extracellulaire via le sarcolemme, soit mixte, dépendant des deux formes. De plus, la littérature indique que, chez le Ver de terre, le potentiel d'action musculaire est provoqué par une entrée d'ions calcium via des canaux spécifiques activés par l'acétylcholine contrairement au cas des vertébrés. Le sodium ne semble pas participer directement à l'établissement du potentiel d'action mais est, en revanche, nécessaire pour que les ions calcium jouent leur rôle, ce qui pourrait expliquer l'effet observé en cas d'absence de sodium dans le milieu.

    Comme on le voit, l'interprétation des mécanismes ioniques impliqués dans le fonctionnement de la synapse neuro-musculaire du Ver de terre est plus complexe que chez les vertébrés. Cela ne doit cependant pas empêcher son utilisation en classe ou il remplacera avantageusement le célèbre gastrocnémien de Grenouille.

    Quoiqu'il en soit, après rinçages dans un milieu normal le muscle retrouve progressivement ses propriétés : l'abolition de la réponse dans le milieu sans calcium souligne le rôle éminent de cet ion dans le déclenchement de la contraction musculaire.



    Conclusion

    Il va sans dire qu'il n'est pas possible de réaliser l'ensemble de ces expériences au cours d'une seule séance de TP d'autant que ce matériel se prête particulièrement bien à l'étude des neuromédiateurs car de nombreuses substances agissent sur lui : par exemple, catécholamines, GABA, sérotonine, caféine, xylocaïne etc.

    On trouvera dans la bibliographie la liste des différentes substances actives ainsi que l'effet de l'excès ou de l'absence de divers ions (chlorure, baryum etc.) ce qui peut sans doute donner d'excellentes idées de TP aux collègues.

    Si on dispose de suffisamment de postes, il devient intéressant de faire travailler chaque groupe sur un seul ensemble de conditions expérimentales afin de confronter les différents résultats en fin de séance.



    Bibliographie 1. Hidaka T. et al (1969) Membrane properties of the somatic muscle (obliquely striated) of the earthworm. J. Exp. Biol. 50, 387-403
    2. Hidaka T. et al (1969) Effects of various ions on the resting and active membrane of the somatic muscle of the earthworm. J. Exp. Biol. 50, 405-415
    3. Ito Y. et al (1970) Effects of divalent cations on spike generation in the longitudinal somatic muscle of the earthworm. J. Exp. Biol. 52, 79-94
    4. Hidaka T. et al (1969) The mechanical properties of the longitudinal muscle in the earthworm. J. Exp. Biol. 50, 431-443
    5. Ito Y. et al (1971) Effects of catecholamines on the neuromuscular junction of the somatic muscle of the earthworm Pheretima communissima. J. Exp. Biol. 54, 167-186
    6. Andersson R. & Fänge R. (1967) Pharmacological receptors of an annelid Lumbricus terrestris. Archives Internationales de Physiologie et de Biochimie, 75, (3) 461-468
    7. Prosser C. L. Comparative Animal Physiology Sauders 1973
    8. Guibault P. et col. Contractures cholinergiques Biologie-Géologie, 4, 1986

    RETOUR AU SOMMAIRE
    Tous droits réservés
    D. Pol, 1998
    dpol#noos.fr
    Emplacements des visiteurs de cette page