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ÉTUDE PRATIQUE DE LA MUTAGENÈSE CHEZ LA LEVURE
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 Introduction

Les programmes du cycle terminal dans la filière scientifique (première et terminale S) font une large part aux problèmes liés à la génétique moléculaire, notamment aux notions de génotype et phénotype et à l'importance des mutations et de leurs conséquences.

Les programmes officiels donnent quelques indications sur la façon d'aborder ces problèmes de manière pratique, essentiellement par l'utilisation de logiciels permettant le traitement de séquences d'ADN et de protéines. Bien que ce type d'activité soit très utile, notamment pour comprendre le "dogme central de la biologie moléculaire", bien d'autres activités pratiques sont envisageables dans le but de concrétiser la notion de mutation et les relations entre génotype et phénotype.

La levure de bière, Saccharomyces cerevisiae, dont l'importance tant économique que scientifique est bien connue, est devenue depuis quelques années l'un des organismes modèles en génétique moléculaire. Le séquençage complet de son génome a été publié en  1996 tandis que les diverses voies de son métabolisme, les gènes qui les contrôlent et les régulations correspondantes sont de mieux en mieux connus.


Le génome complet est accessible notamment à cette adresse.


<>Sans insister sur les multiples avantages de la levure comme matériel biologique, on peut cependant noter qu'elle constitue un matériel de choix pour apprendre à maîtriser les techniques indispensables à la culture des microorganismes.
De très nombreuses mutations sont connues chez la levure et concernent principalement leurs capacités métaboliques comme l'auxotrophie pour diverses petites molécules (acides aminés, bases azotées ou vitamines) ou la possibilité d'utiliser divers sucres comme source de carbone. Une de ces mutations appelée ade2 conduit à l'inactivation d'une enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'adénine. Elle présente l'intérêt de se traduire par un phénotype visible à l'œil nu puisque les souches affectées forment des colonies de couleur rose à rouge dans certaines conditions.
Le principe des manipulations présentées ci-dessous est de provoquer des mutations chez l'une de ces souches. Certaines de ces mutations se traduiront par un retour à la couleur crème habituelle des colonies et seront donc aisément détectables.


Colonies de la souche ade2 en culture.
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I- La chaîne de biosynthèse de l'adénine et les mutations ade

Les souches sauvages de S. cerevisiae ne nécessitent pas d'adénine pour se développer car elles disposent d'une chaîne de biosynthèse qui, à partir d'un précurseur, le phosphoribosyl-pyrophosphate (PRPP) conduit à l'adénosine monophosphate (AMP) à travers une douzaine de réactions biochimiques catalysées par autant d'enzymes. Des mutations ont été identifiées dans la plupart des douze gènes codant pour ces enzymes. Elles conduisent à des mutants auxotrophes pour l'adénine (mutants ade-). Il faut noter que la numérotation de ces mutations correspond à l'ordre de leur découverte et non à la place de l'enzyme correspondante dans la séquence de réactions.

La figure ci-dessous montre la chaîne de biosynthèse de l'adénine et les mutations qui l'interrompent (gènes en vert, enzymes en rouge, produits en bleu ; l'allèle ade2 et l'enzyme correspondante sont soulignés, l'AIR qui s'accumule chez le mutant utilisé est en marron).

La mutation ade 2

Lorsqu'une levure possède la mutation ade2, l'interruption de la chaîne de biosynthèse au niveau de l'enzyme 6 a pour conséquences que l'AIR n'est plus transformé en CAIR et qu'il s'accumule dans les cellules. Lorsque les cellules fonctionnent en aérobiose, l'oxydation de cette substance conduit à un pigment rouge par un mécanisme mal connu. Il en résulte que les colonies se développant sur milieu solide à partir de cellules ade2 ont une couleur rose à rouge et sont aisément repérables. Notons que la mutation ade1 offre des caractéristiques similaires à celles de la mutation ade2 ce qui permet d'utiliser une souche ade1 au lieu d'une souche ade2 dans les manipulations présentées.

Inversement, toute nouvelle mutation se produisant dans un gène correspondant à une enzyme placée en amont de l'enzyme 6 ne permettra pas l'accumulation d'AIR et les colonies développées à partir de tels mutants auront la couleur crème habituelle des colonies de levure de bière.

De telles mutations sont dites "suppresseurs" car elles font disparaître le phénotype caractéristique d'une autre mutation.

De la même façon, une mutation réverse qui restaurerait l'activité de l'enzyme 6 rétablirait la couleur crème. Toutefois, la manipulation présentée ci-dessous ne permet pas de différencier mutations suppresseur et réverse. Pour cela, il faudrait, en effet, tester les mutants pour leur capacité à pousser sur un milieu minimum dépourvu d'adénine ce qui reste, bien entendu, possible si l'on désire aller plus loin.

Conditions nécessaires à la formation du pigment rouge

En plus d'une mutation ade1 ou ade2, d'autres paramètres d'ordre génétique et environnemental peuvent interférer avec la formation de colonies de couleur rouge.

Les levures, comme toutes les cellules vivantes, possèdent des systèmes de régulation métabolique très efficaces. Ainsi, si de l'adénine est présente dans le milieu en quantité suffisante, la chaîne de biosynthèse de l'adénine sera réprimée et les levures transformeront directement l'adénine fournie en AMP. Il en résulte que si le milieu contient de l'adénine en concentration non limitante, les colonies auront la couleur habituelle car l'AIR ne sera pas synthétisé. Toutefois, avec les milieux les plus courants contenant de l'extrait de levure et de la peptone, la quantité d'adénine est insuffisante pour bloquer la chaîne de biosynthèse mais suffisante pour que les levures survivent. En conséquence, un milieu d'usage général pourra être utilisé pour les manipulations.

On a signalé plus haut que la formation du pigment ne peut avoir lieu qu'en aérobiose. Lorsqu'une levure présente une mutation dans un gène indispensable à la respiration, elle ne pourra plus oxyder l'AIR. Une colonie issue d'une telle cellule ne sera donc pas pigmentée.

Les levures présentent spontanément des mutations de l'ADN mitochondrial avec une fréquence exceptionnellement élevée. Lorsque elles sont exposées à un agent mutagène, cette fréquence augmente encore. Les levures ayant perdu la capacité à respirer sont appelées RD (respiratory deficient). Le génotype correspondant aux mutations de l'ADN mitochondrial est dit r- (rho-) et affecte le plus souvent la synthèse d'éléments de la chaîne de transfert des électrons.

Les colonies r - incapables de respirer fermentent les substrats et se développent donc moins vite que celles qui respirent étant donné la différence de rendement énergétique entre les deux métabolismes. Sur milieu solide, leur diamètre est plus petit et elles ont reçu le nom de mutants "petite". Par ce simple caractère, il est aisé de les différencier des mutants suppresseurs ou réverse. De plus, non seulement elles ne forment pas de pigment rouge, mais pour la plupart elles ne fabriquent pas non plus de cytochrome. Aussi leurs colonies sont-elles de couleur blanche plutôt que crème. On dispose ainsi de deux critères pour identifier les mutations affectant la respiration.

Ces remarques sur la physiologie de la formation du pigment et son contrôle permettent d'envisager d'autres expériences : il est ainsi possible de tester l'interaction entre l'expression d'un gène et les conditions de milieu et donc d'explorer les relations complexes entre génotype et phénotype en cultivant en parallèle des colonies sur milieu solide additionné ou non d'adénine en aérobiose et en anaérobiose. Toutefois, nous nous limiterons ici au protocole de mutagenèse.

Colonies mutantes chez la souche ade2.
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Colonies mutantes et sauvage chez la levure ade2


II- Aspects pratiques

Précautions
 

  • Toutes les opérations doivent être menées en conditions stériles.
  • Ne pas oublier d'agiter soigneusement le tube avant chaque prélèvement pour remettre les cellules en suspension.
  • Lors du comptage des colonies, éliminer les boîtes chez lesquelles une erreur de manipulation est manifeste : contamination par d'autres champignons, absence de colonies dans une boîte non exposée etc.
Si on ne dispose pas d'étuve, les boîtes seront incubées à température ambiante et les résultats visibles après une semaine.


Protocole

1- Prélever stérilement une colonie de S.cerevisiae ade1 ou ade2 et la mettre en suspension dans 10 mL d'eau stérile dans un tube standard de culture. C'est la suspension mère.

2- Agiter au vortex pour bien séparer les cellules.

3- Prélever une goutte de la suspension et déterminer la concentration en cellules de la suspension mère avec une lame à numération. Diluer si nécessaire pour faire la numération.

4- Diluer la suspension mère de façon à obtenir entre 500 et 1000 cellules par mL. Cette dilution devrait permettre à tous les élèves d'utiliser la même suspension d'origine pour ensemencer leurs boîtes.

NB S'il est nécessaire d'utiliser deux suspensions mères différentes, faire deux séries de manipulations indépendantes.

L'ordre de grandeur du nombre de cellules dans une colonie ordinaire de S. cerevisiae est de 100 millions. En principe, la mise en suspension d'une colonie dans 10 mL d'eau doit donc donner de l'ordre de 106 cellules/mL. Toutefois, il ne s'agit que d'un ordre de grandeur et il est donc plus précis de déterminer la concentration réelle avec une lame à numération.

5- Déposer 0,1 mL de la suspension diluée (soit 50 à 100 cellules) au milieu de la boîte et refermer le couvercle.

[Si l'on ne dispose pas de pipette de précision, déposer avec une pipette Pasteur 3 gouttes de la suspension diluée.]

6- Enlever le couvercle de la boîte et le poser face creuse vers le haut à côté de la boîte sous le tube à UV. Exposer chaque boîte pendant une durée déterminée. Celle-ci dépend de l'énergie fournie par le tube et peut donc varier largement. Il faudra donc faire quelques essais préalables.

Ne pas oublier de faire quelques boîtes témoin non exposées.

7- Remettre le couvercle avant de sortir la boîte de l'enceinte à UV.

8- Etaler l'échantillon soigneusement à la surface de la boîte avec une pipette Pasteur boutonnée transformée en râteau en pliant l'extrémité à la flamme selon les indications ci-après :



Résultat :

Râteau pour l'étalement

9- Noter sur une étiquette les paramètres utilisés et la date et la coller sur le côté de la boîte.

10- Placer les boîtes, couvercle vers le bas, à l'étuve à 30oC pendant trois à quatre jours.

11- Compter le nombre de colonies apparues dans chaque boîte et calculer le pourcentage de survivants dans chaque cas par rapport à la moyenne des boîtes non exposées (valeur 100).

12- Compter le nombre de colonies dont le phénotype diffère de la souche d'origine par la couleur (crème ou blanc).



III- Construction des graphiques
Courbe de survie en fonction de la dose de rayonnement
Construire le graphique exprimant le nombre de colonies survivantes en fonction de la durée d'exposition aux UV
  • soit le nombre absolu de colonies pour chaque boîte (cas du graphique ci-dessous : losanges)
  • soit la moyenne des boîtes pour chaque durée d'exposition aux UV (cas du graphique ci-dessous : carrés)
  • soit le pourcentage de survivants par rapport aux témoins (moyenne des boîtes non exposées : 100 %)
  • Courbe de survie


    Nombre de colonies obtenues sur chaque boîte après exposition de durée croissante au rayonnement ultra-violet
    Losanges : nombre de colonies décompté dans chaque boîte
    Carrés : moyenne du nombre de colonies pour chaque durée d'exposition


    Nombre de mutants en fonction de la dose de rayonnement
    Construire le graphique exprimant le nombre de colonies mutantes en fonction de la durée d'exposition.
  • Soit le nombre absolu de colonies mutantes par boîte  (cas du graphique ci-dessous : losanges).
  • Soit la moyenne du nombre des colonies mutantes pour chaque durée d'exposition (cas du graphique ci-dessous : carrés)
  • Soit le pourcentage de colonies mutantes par rapport au nombre de survivants.

  • Courbe des mutations


    Nombre de colonies mutantes obtenues en fonction de la durée d'exposition au rayonnement ultra-violet
    Losanges : nombre de colonies mutantes décomptées dans chaque boîte
    Carrés : moyenne du nombre de colonies mutantes pour chaque durée d'exposition



    Fournisseur de la souche ade2 et du milieu :
    SORDALAB
    15 avenue des Grenots
    91150 ETAMPES
    FRANCE
    Téléphone :
    01.69.92.26.72
    Fax :
    01.69.92.26.74
    sordalab@wanadoo.fr

    Milieux utilisables
    Gélose de Sabouraud pauvre en adénine, YPG sans adénine (additionné de traces d'adénine). Il est utile mais non indispensable d'utiliser des milieux additionnés d'antibiotiques.
    Il est indispensable d'utiliser un milieu pauvre en adénine pour que les colonies apparaissent rouges. Un excès d'adénine inhibe la voie de biosynthèse.

    Remerciements
    Les levures ade2 utilisées pour mettre au point ce protocole ont été aimablement fournies par madame MASSELOT, professeur de génétique à l’Université Pierre & Marie Curie, que nous remercions.

    Bibliographie
    - Johnston M. & Carlson M. The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces, Volume II : Gene Expression. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992
    - Manney T.R. & Manney M.L. Using Yeast genetics to generate a research environment. Genetics, 134, mai 1993
    - Manney T.R. & Manney M.L. Handbook for Using Yeast to Teach Genetics. Kansas State University, 1991
    - Pol D. Travaux pratiques de biologie des levures. Ellipses, 1996

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