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RÉALISER EN CLASSE L’ÉLECTROPHORÈSE DE L’ADN
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Introduction

Les programmes du cycle terminal dans la filière scientifique (première S et TS) font une large place aux problèmes liés à la génétique en général et à la génétique moléculaire en particulier. Dans ces classes, les élèves doivent assimiler les notions de base concernant les relations entre information génétique et ADN (notions de support chimique de l’information, de gène, de codage...) et entre génotype et phénotype (expression des gènes, mutations, polymorphisme...). Diverses activités pratiques sont souvent menées dans ce cadre comme l’extraction de l’ADN génomique, la construction de maquettes, la manipulation de séquences au moyen de logiciels spécialisés etc. Toutefois, si ces activités permettent de résoudre divers problèmes, un des principaux outils de la biologie moléculaire, l’électrophorèse sur gel, est, le plus souvent, décrit ou illustré à l’aide de schémas et de documents audiovisuels. Il s’agit pourtant d’une technique essentielle. Sans elle, les formidables progrès des connaissances sur les structures et les fonctions des acides nucléiques n’auraient pas été possibles. Des opérations désormais courantes comme l’identification de gènes par des sondes, la cartographie du génome, le séquençage des gènes, l’amplification de segments d’ADN (PCR) ainsi que l’ensemble des applications issues des techniques de l’ADN recombinant, pour ne citer que quelques exemples, n’auraient pu être mises au point : elles nécessitent toutes, à un moment ou à un autre, le recours à l’électrophorèse.

Il est donc important que les élèves connaissent les principes et les applications de cette technique mais aussi ses difficultés pratiques et ses limites. Quoi de plus stimulant pour atteindre cet objectif que de pratiquer soi-même la technique et d’en voir concrètement les résultats ? De plus, si les développements de la biologie moléculaire et la moisson de connaissances qui en résulte sont aussi extraordinaires, il ne faudrait pas que les élèves s’imaginent que tout cela est d’une simplicité enfantine : réduit à quelques schémas l’ADN finirait par être " désincarné " et les travaux de génétique moléculaire apparaîtraient alors d’une simplicité extrême, ce qui est loin d’être le cas. En revanche, la confrontation avec la réalité expérimentale et sa mise en relation avec les connaissances théoriques devrait favoriser la construction de son savoir par l’élève en accord avec les objectifs de l’enseignement des SVT.

Différents auteurs ont proposé en France comme à l’étranger des activités pratiques incluant l’électrophorèse (4, 5). Dans cet article les obstacles qui s’opposent à la mise en œuvre de cette technique au lycée et les solutions adoptées pour les contourner sont décrits en premier lieu. On trouvera ensuite un exemple d’application de la méthode à la séparation de fragments de l’ADN du bactériophage l obtenus par l’action d’enzymes de restriction. Enfin, une description détaillée du protocole d’électrophorèse et les informations utiles pour la mener à bien (fournisseurs, prix) sont données en annexe.


Obstacles et solutions

Les principales difficultés s’opposant à la réalisation par les élèves d’électrophorèses de l’ADN concernent le coût et la sécurité, la mise en œuvre de la technique elle-même ne présentant pas de difficulté majeure.

Pour mener à bien une telle opération, il faut disposer d’une cuve pour électrophorèse de gels immergés avec les éléments annexes comme le support de coulage, les joints, les peignes, d’une alimentation d’une centaine de volts en courant continu, de divers produits chimiques (ADN, tampons, agarose, bromure d’éthidium....), de micropipettes, d’une table à ultraviolets (UV) pour l’observation des gels et de lunettes de protection contre les UV.

Le montant des dépenses pour acquérir un tel équipement est donc incompatible avec le budget de la plupart des laboratoires de SVT. En outre, pour des raisons de sécurité, la manipulation du bromure d’éthidium utilisé pour révéler les bandes d’ADN par fluorescence est à éviter en classe car il s’agit d’une substance hautement mutagène. De même, l’utilisation d’une table à UV, nécessaire pour révéler les bandes d’ADN marquées par le bromure d’éthidium, peut poser des problèmes de sécurité si des élèves oublient de porter les nécessaires lunettes protectrices.

La technique classique est donc difficilement applicable en classe en l’état.

Cependant, un procédé alternatif de coloration de l’ADN ne nécessitant pas de bromure d’éthidium a été mis au point il y a quelques années pour s’affranchir de la manipulation de ce produit dangereux (1). Ce procédé a aussi l’avantage d’éviter le recours à une table à UV. Dans ces conditions, l’investissement nécessaire baisse considérablement et les problèmes de sécurité restent alors du même ordre que ceux rencontrés lors de n’importe quelle séance de travaux pratiques.

Il est possible de construire soi-même une cuve à électrophorèse mais cela n’apparaît pas vraiment indispensable dans la mesure où l’on en trouve maintenant pour un prix accessible avec les accessoires nécessaires.

Concernant l’alimentation, celles qui sont vendues par les distributeurs de matériel pédagogique pour alimenter les cuves pour électrophorèse de protéines sur gel d’acétate de cellulose conviennent parfaitement et sont en général d’un prix abordable. Si l’on ne dispose pas d’une telle alimentation, on peut alimenter la cuve avec des piles mises en série (12 piles de 4.5 V) ou avec une alimentation continue prêtée par le laboratoire de physique (12 à 90 V, 150 mA minimum) voire avec un petit bloc d’alimentation comme il en existe pour divers appareils basse tension. Dans ce dernier cas, le seul inconvénient est la durée de la migration car il faut alors laisser migrer plusieurs heures. Avec une alimentation de 50 V, la durée de migration est ramenée à 1h30 et à 1 h avec une alimentation de 90 à 120 V. Toutefois, plus la migration est brève et moins la séparation des bandes est fine.

On trouvera en fin d’article la liste des fournitures et l’adresse de divers fournisseurs.

Les principes de l’électrophorèse ont été exposés dans le bulletin de l’APBG (2) en ce qui concerne les protéines et peuvent être également trouvés dans divers ouvrages (3). Si les principes physico-chimiques restent les mêmes, les méthodes diffèrent pour l’électrophorèse de l’ADN notamment en ce qui concerne le tampon et le support. Le tampon est une solution contenant du Tris [tris(hydroxyméthyl)aminométhane], du borate, de l’EDTA (Ethylène diamine tétraacétate) ajustée à pH 8,3 (tampon TBE). Le support de migration est un gel d’agarose dans lequel des puits sont formés à une extrémité pour recevoir les échantillons. En outre, le gel est ici immergé dans le tampon qui remplit également les deux réservoirs où se trouvent les électrodes. L’agarose constitue un milieu plus ou moins poreux : plus sa concentration est forte et plus les pores sont petits. La concentration à utiliser dépend donc de la taille des fragments à séparer.

Au pH de la solution tampon, l’ADN présente des charges négatives dues aux groupes phosphates et migre donc vers l’anode. Les fragments d’ADN migrent d’autant plus vite qu’ils sont plus petits en raison de la dimension des pores du gel et, à la fin de la migration, les fragments les plus petits correspondent aux bandes les plus éloignées du puits de départ.

Un colorant de charge, le bleu de bromophénol, permet de suivre visuellement l’avancement de la migration. Il est dissous dans une solution de saccharose concentrée qui, une fois mélangée à la solution d’ADN, densifie suffisamment le mélange pour qu’il ne s’échappe pas des puits vers le tampon contenu dans la cuve.

Le tableau ci-dessous montre la dimension des fragments issus de l’action de deux enzymes de restriction Hind III et EcoR I sur l'ADN du bactériophage lambda.
 
 

EcoR I 
Hind III
EcoR I + Hind III
21226
23130
21226
7421
9416
5148
5804
6557
4973
5643
4361
4268
4878
2322
3530
3500
2027
2027
 
564
1904
 
125
1584
   
1375
   
947
   
831
   
564
   
125

Il est facile de se procurer la séquence complète de l’ADN du phage via Internet sur les banques de données internationales (Genbank, NCBI...). On pourra alors rechercher les sites de restriction correspondant aux deux enzymes en utilisant la fonction " rechercher " d’un traitement de texte et vérifier si les résultats expérimentaux sont en accord avec les résultats attendus compte tenu de la séquence de l’ADN.

Cet article étant avant tout technique, on trouvera une exploitation pédagogique plus détaillée de ce type de manipulation dans les références 4 et 5.



Préparation du matériel et des solutions

Gel d’agarose

1- Mélanger tampon TBE et agarose à raison de 1 g d'agarose pour 100 mL de tampon. Faire bouillir pour faire fondre l'agarose ou passer au four à micro-ondes en surveillant pour éviter les projections.

2- Laisser refroidir jusqu'à environ 60°C (jusqu'à ce qu’il devienne possible de saisir le flacon à main nue). Placer les joints prévus pour fermer le support de gel et positionner le peigne à 1 mm du fond et à environ 1 cm de l’extrémité du support. Utiliser un peigne à 4 dents.

Certains peignes sont réglables avec une vis : il y a alors une cale pour régler leur hauteur. D’autres sont préadaptés au support et ne nécessitent pas de cale.

3- Couler lentement le gel sur 2 à 3 mm d'épaisseur en veillant à ce qu’il entoure bien les dents du peigne.

4- Laisser refroidir, enlever le peigne et les joints et procéder au dépôt des échantillons.

NB On peut préparer le gel à l’avance et le conserver solide au réfrigérateur dans un flacon en verre (rempli aux 2/3 maximum). Au moment de l’emploi, refondre le gel au four à micro-ondes (en surveillant pour éviter les projections) ou au bain-marie bouillant.



Tampon TBE (Tris borate EDTA) pH 8.3 Pour 1000 mL d’eau distillée
Tris.HCl [tris(hydroxyméthyl)aminométhane] 90 mmol.L-1 10.89 g
Acide borique 90 mmol.L-1 5.56 g
EDTA 2 mmol.L-1 0.74 g (sel disodique de l’acide éthylène diamine tétraacétique)


Préparation et dépôt des échantillons

On peut faire agir des enzymes de restriction sur de l’ADN extrait en classe mais le protocole est long et difficile. Pour éviter cette phase, il est plus simple d’acheter dans le commerce des échantillons d’ADN du bactériophage l , entier ou digéré par des enzymes de restriction. Cette solution donne l’assurance de beaux résultats mais elle revient un peu plus cher.

- Les échantillons d'ADN peuvent être obtenus en solution dans un tampon TE (Tris EDTA) ou lyophilisés. Dans ce cas, il sont remis en solution dans du tampon TE (1 unité d’ADN dans 50 µL).

NB La solution d'ADN peut être conservée indéfiniment à - 20 °C. Il vaut mieux la répartir en aliquots de 20 µL dans des microtubes avant congélation.

Les échantillons d’ADN sont fournis avec du colorant de charge chez Sigma. Il ne reste plus qu’à les mélanger avant le dépôt.

- Pour le remplissage de chaque puits, mélanger 10 µL de colorant de charge avec 10 µL d ’ADN sur un morceau de parafilm (réaliser les dilutions de façon à obtenir de 1 à 10 µg d’ADN par puits ; les bandes sont plus fines mais moins intensément colorées pour les faibles concentrations et vice-versa : voir photographies).

Les échantillons sont prélevés avec une micropipette en changeant de cône à chaque prélèvement. Si l’on ne dispose pas de micropipette, il est possible d’utiliser une seringue jetable de 1 mL équipée d’un cône de micropipette. Dans ce cas, il faut manipuler la seringue avec la plus grande délicatesse pour déposer les volumes voulus.

- Remplir quatre puits : 1- ADN entier ; 2- fragments obtenus par action de Hind III ; 3- fragments obtenus par action de EcoR I ; 4- fragments obtenus par action de EcoR I et Hind III).

- Placer le support avec le gel dans la cuve d'électrophorèse, puits du côté de la cathode (pôle noir).

- Recouvrir de tampon TBE (réutilisable plusieurs fois).

Commencer par remplir les deux réservoirs puis verser très lentement lorsque le tampon commence à recouvrir le gel. En cas de mouvement brusque, l’échantillon risque de se dissoudre dans le tampon.

- Fermer la cuve, brancher les fils et mettre sous tension. Les systèmes de sécurité des cuves actuelles interdisent l’accès à l’intérieur de la cuve sous tension.

- Laisser migrer jusqu’à ce que les tâches de bleu de bromophénol arrivent à 1 cm de l'extrémité du gel.

- Couper l’alimentation, débrancher les connections et récupérer le gel dans son support. Attention au transport : le gel glisse très facilement de son support.



Tampon TE (Tris EDTA) pH 7,6 Pour 100 mL d’eau distillée

Tris.HCl [tris(hydroxyméthyl)aminométhane] 1 mol.L-1 12,1 g
EDTA 0,1 mol.L-1 3,72 g (sel disodique de l’acide éthylène diamine tétraacétique)

Colorant de charge pH 8 Pour 10 mL d’eau distillée

Bleu de bromophénol 3 mmol.L-1 0,2 g
Saccharose 1,5 mol.L-1 5,1 g
Tris. HCl 10 mmol.L-1 0,01 g



Révélation des bandes d’ADN

Attention, le gel doit être manipulé avec soin car il est très fragile.

- Plonger le gel dans la solution de coloration pendant 20 min.

- Récupérer le colorant (qui peut être réutilisé) et transférer le gel dans un cristallisoir rempli d’eau tiède. Changer l’eau de temps en temps. Autre possibilité : laisser couler un mince filet d’eau tiède sur le gel en veillant à ce que ce dernier ne sorte pas de son récipient et à ce qu’il ne se déchire pas (laisser couler l’eau très lentement, recouvrir le gel d’une grille éventuellement). Poursuivre jusqu’à décoloration du fond.

Selon la température de l’eau et sa vitesse de renouvellement, la décoloration du fond peut être plus ou moins complète en quelques heures.

- Les bandes d’ADN apparaissent en bleu foncé sur un fond bleu clair.

Voir des photographies de gels

NB Si le gel a été décoloré au point que les bandes d’ADN s’estompent, on peut recommencer le protocole de coloration/décoloration.

Une méthode de coloration des gels par l'Azure A
Une méthode de coloration des gels par le bleu de Nile (la méthode la plus efficace)



Solution de coloration pour les gels Pour 100 mL d’eau distillée

Bleu de méthylène 2,6 mmol.L-1 0,1 g
Acétate de sodium 0,5 mol.L-1 4,1 g



Echantillons d’ADN : fournisseurs

SIGMA
L’Isle d’Abeau Chesnes, BP 701 38297 Saint Quentin Fallavier Cedex
Tel : 0474822800

EUROMEDEX  24, rue des Tuileries 67460 Suffelweyersheim
Tél : 03 88 18 07 22
ADN de phage lambda, 0.5 mg
Hydrolysat d’ADN de phage lambda produit par EcoR I, 0.25 mg
Hydrolysat d’ADN de phage lambda produit par Hind III, 0.25 mg
Hydrolysat d’ADN de phage lambda produit par EcoR I et Hind III, 0.25 mg

SERLABO (distributeur de WORTHINGTON)
BP 82 94382 Bonneuil sur Marne Cedex
0149805000
serlabo#wanadoo.fr



Bibliographie 1- Young-Sharp D. & Kumar R. Protocols for the visualisation of DNA in electrophoretic gels by a safe and inexpensive altenative to ethidium bromide. Technique, 1 (3), 1982.
2- Raithouze N. & D. Electrophorèse au lycée. Biologie Géologie, 2, 1993
3- Salvinien J. Electrophorèse. Encyclopaedia Universalis, 1990
4- Auclair J.J. & Dupont J.Y. De l’électrophorèse des fragments d’ADN à la compréhension de l’action des enzymes de restriction. Actes du colloque ENS - INRP " Informatique et communications dans l’enseignement des SVT ", Paris 15, 16, 17 octobre 1997
5- Barry Miller M. Practical DNA technology in school. Journal of Biological Education, 28 (3), 1994.
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