Introduction La bioluminescence, émission de lumière froide par des êtres vivants, fait partie de ces phénomènes biologiques qui suscitent une foule de travaux de recherches fondamentale et appliquée (2) et ouvrent la voie à diverses applications pédagogiques dont l’intérêt didactique a été souligné à différentes reprises (3, 4, 5). En provoquant l’étonnement par son caractère spectaculaire et esthétique elle contribue à stimuler la curiosité et le désir de comprendre. Les applications de la bioluminescence développées pour la biochimie, la biologie moléculaire et les biotechnologies (dosage de divers métabolites, gènes rapporteurs, sondes marquées, détection de contaminations bactériennes etc.) constituent des outils puissants de plus en plus utilisés dans les laboratoires de recherche et dans l’industrie en particulier pour éviter le recours aux marqueurs radioactifs. Certaines de ces applications peuvent être adaptées pour une utilisation pédagogique. Ainsi, l’utilisation de la luminescence du mélange luciférine - luciférase de la luciole permet non seulement la détection et le dosage de l’ATP (5) mais aussi le suivi de diverses réactions enzymatiques impliquant l’ATP. Dans ce type d’application, il n’est pas nécessaire d’avoir recours aux organismes luminescents eux-mêmes dont l’approvisionnement et l’entretien sont souvent difficiles au laboratoire puisque l’on travaille avec des extraits achetés dans le commerce. En revanche, les bactéries luminescentes peuvent être obtenues et cultivées facilement au laboratoire rendant possibles des investigations aussi bien in vivo qu’in vitro. Deux familles de bactéries, les Vibrionacées et les
Entérobactériacées
présentent des représentants luminescents. Il est
possible
de s’en procurer aisément soit en réalisant un isolement
à partir d’un échantillon biologique (3) soit plus
simplement
dans le commerce (7). La culture de bactéries luminescentes et
la
bioluminescence elle-même sont porteuses d’un considérable
potentiel pédagogique car elles conduisent à s’interroger
sur de multiples problèmes biologiques et à les
résoudre
en intégrant des activités pratiques diversifiées.
Outre l’acquisition des gestes techniques fondamentaux de la
microbiologie,
la mesure de l’émission lumineuse peut être
utilisée
pour établir la cinétique de croissance d’une population
bactérienne et pour explorer les conditions de vie de ces
organismes
et leur métabolisme. Des bactéries luminescentes sont
également
utilisées comme organismes indicateurs dans des tests
biologiques
(1), outils de surveillance de l’environnement. Ainsi, un test
commercial
comme le test MICROTOX® permet de tester le potentiel toxique des
eaux
à l’aide de bactéries luminescentes. Comme le montre
cette
rapide revue, les propriétés étonnantes des
bactéries
luminescentes ouvrent la voie à une large gamme d’applications
pédagogiques.
Nous en donnerons ici quelques exemples concrets.
Aspects pratiques Les bactéries luminescentes utilisées (Photobacterium phosphoreum et Vibrio harveyi) ont été obtenues auprès de la Collection de souches bactériennes de l’Institut Pasteur (souches 102511 T et 103192 T) mais peuvent être obtenues auprès d’autres fournisseurs comme le Belgian Coordinated Collection of Microorganisms (BCCM)ou d’autres collections mondiales de micro-organismes. Il s’agit de bactéries non pathogènes pour l’homme utilisées dans plusieurs pays au niveau scolaire. Le maintien de ces bactéries au laboratoire tout au long de l’année n’est pas problématique et relève des techniques générales de la microbiologie : repiquage régulier sur un milieu synthétique à base d’eau de mer artificielle additionnée de divers nutriments et d’agar pour le solidifier ou congélation. Les milieux sont préparés au laboratoire mais les élèves apprennent les techniques de base de la microbiologie afin de pouvoir repiquer eux mêmes les bactéries. Il faut noter que les méthodes de travail en conditions stériles ainsi acquises sont de nouveau utilisées dans la suite du programme pour réaliser notamment des cultures de végétaux in vitro. Plusieurs étapes ont été prévues de façon à insérer l’ensemble des activités pratiques dans les différents chapitres du programme au cours de l’année scolaire. En principe, chaque étape correspond à une séance de TP mais, en fonction des plus ou moins grandes difficultés rencontrées par les élèves, des séances supplémentaires peuvent s’avérer nécessaires. 1) Importance des micro-organismes et techniques microbiologiques Place dans le programme Des manipulations de microbiologie sont menées dès le début de l’année à l’occasion de l’étude de la biosphère (" Diversité du vivant et peuplement des milieux ; l’écosystème, niveau d’organisation du monde vivant "). Objectifs Sur le plan technique, les procédures de travail en conditions stériles permettent d’obtenir des cultures pures de micro-organismes et de les multiplier. Il s’agit de techniques microbiologiques communes permettant de montrer l’importance et la diversité des micro-organismes qui constituent 50 % de la biomasse de la planète. Cette première série d’activités est réalisée sur des levures, plus simples à utiliser pour une première approche ; c’est l’occasion de distinguer des catégories de micro-organismes, levures et bactéries ; enfin l’utilisation de levures permet de réinvestir les connaissances acquises en troisième sur ces micro-organismes. Activités A partir de prélèvements faits dans l’environnement (feuilles, cailloux, eau etc.), les élèves commencent par isoler des levures sur un milieu sélectif puis apprennent à les identifier et à les repiquer pour obtenir une culture pure. Cette étape permet, sur le plan technique, d’assimiler les gestes indispensables, de comprendre la nécessité de strictes conditions d’asepsie et la prise en main du microscope. Elle conduit à la distinction entre eucaryotes et procaryotes. 2) Les bactéries luminescentes Place dans le programme Les bactéries luminescentes sont introduites à l’occasion de l’étude des écosystèmes. Les élèves observent et manipulent alors une autre catégorie de micro-organismes, nouvel exemple de la diversité du vivant. En outre, l’observation de la bioluminescence est non seulement spectaculaire et capte l’attention des élèves, mais elle conduit également à poser des problèmes biologiques divers en relation avec le fonctionnement des écosystèmes (métabolisme des bactéries, symbiose, place dans les écosystèmes). Objectifs Il s’agit ici de mettre en application les techniques apprises précédemment de façon à entretenir les souches bactériennes pour en disposer le moment venu et d’observer les bactéries et leur luminescence. Même si l’étude des bactéries et de la bioluminescence ne sont pas les objectifs de ce travail, cette séance est utilisée pour quelques rappels des connaissances de troisième sur les bactéries et pour apporter les informations nécessaires à la compréhension de la démarche scientifique suivie. A l’issue de cette séance, chaque groupe de deux élèves dispose d’une culture de bactéries luminescentes. La qualité du travail pratique réalisé est facilement évaluée par un examen visuel à l’obscurité dans les jours qui suivent. Réalisée collectivement, l’évaluation est un moment de détente ! Activités A partir des souches disponibles au laboratoire, chaque groupe de deux élèves met en suspension un échantillon de la culture avant de procéder à son étalement sur milieu solide. Ces opérations sont menées en conditions stériles de façon à éviter les contaminations par d’autres espèces de micro-organismes qui empêcheraient le développement des bactéries luminescentes. Les bactéries sont également observées au microscope après coloration et peuvent être éventuellement dénombrées et mesurées. En outre, une réflexion est menée pour mettre en relation les constituants du milieu de culture avec le métabolisme de ces organismes et leur place dans les écosystèmes. 3) Prise en main de la chaîne de mesure Place dans le programme Cette étape de la démarche ne correspond pas à un chapitre précis du programme mais est nécessaire pour pouvoir utiliser l’ordinateur comme outil de laboratoire. Comme l’ExAO est utilisée dans différents chapitres du programme, cette prise en main est faite aussi tôt que possible. Objectifs Sur le plan technique, il s’agit de comprendre les principes de l’ExAO et de se familiariser avec l’utilisation de l’ordinateur et la manipulation de données scientifiques informatisées. Sur le plan des connaissances, il s’agit de mettre en relation l’émission de lumière avec le métabolisme des bactéries en montrant que l’oxygène est indispensable pour la production de lumière et que cette dernière est le résultat d’une réaction chimique. Activités Les élèves mettent en suspension dans un milieu liquide approprié les bactéries issues de leur propre culture et apprennent à mesurer la lumière émise avec la chaîne de mesures informatisée. Ils observent la cinétique de l’émission lumineuse et formulent des hypothèses pour l’expliquer. Les hypothèses sont ensuite mises à l’épreuve expérimentale et la comparaison des résultats obtenus dans différentes conditions (quantité de bactéries introduites dans la cuve de mesure, aération) permet de valider certaines d’entre elles, notamment la nécessité de l’oxygène. 4) Application pratique Les bactéries sont utilisées dans un test biologique comme indicateurs de toxicité. Les substances toxiques susceptibles d’être présentes dans un milieu (métaux lourds notamment) induisent une diminution de l’intensité lumineuse des bactéries. La mesure de l’émission lumineuse en présence de divers échantillons permet ainsi d’évaluer leur toxicité globale et de rechercher éventuellement les substances responsables. Place dans le programme La mise en œuvre du test biologique est faite au moment de l’étude du chapitre " Approvisionnement en eau et gestion des réserves " dans le cadre de l’étude des pollutions. Objectifs Sur le plan technique, il s’agit de réinvestir les apprentissages précédents pour élaborer une procédure expérimentale, de réaliser l’acquisition des données et d’utiliser les données acquises pour résoudre les problèmes posés. Sur le plan des connaissances, il s’agit d’assimiler les principes généraux d’un test biologique, de mettre en relation la décroissance de l’émission lumineuse des bactéries avec le caractère toxique des substances testées et de tirer des informations pertinentes de l’analyse des graphiques obtenus. Activités Les élèves mesurent l’intensité de luminescence
de leur suspension bactérienne en présence de
concentrations
croissantes de substance toxique. Ils construisent à partir des
données obtenues le graphique représentant
l’intensité
de luminescence en fonction de la concentration en substance toxique et
les courbes dose - réponse tracées pour diverses
substances
toxiques (sels de métaux lourds, substances chimiques diverses)
sont utilisées pour déterminer la CI50. Dans
un
second temps, divers échantillons provenant de l’environnement
(eaux,
rejets, produits domestiques) sont testés, les graphiques
correspondants
sont construits et les résultats sont discutés
collectivement.
Aspects techniques Entretien de la souche La souche bactérienne est régulièrement repiquée stérilement sur agar nutritif. Pour cela, un échantillon est prélevé avec une anse stérile et étalé en stries à la surface du milieu. Les boîtes de Pétri sont ensuite mises à incuber à la température du laboratoire. La bioluminescence se développe en général au bout de 18 à 24 h et se maintient de deux à quatre jours. En repiquant la souche régulièrement, on dispose en permanence de cultures prêtes à l’emploi car dès que la luminescence des boîtes devient visible, elles sont placées au réfrigérateur jusqu’au moment de l’emploi. Après sortie du réfrigérateur, les capacités de bioluminescence sont pratiquement inchangées et se manifestent dès le retour à température ambiante. Observation de la bioluminescence Pour observer la luminescence des colonies bactériennes sur
milieu
solide, il faut disposer d’une pièce où peut être
réalisée
une obscurité totale. Après une à deux minutes
d’adaptation
de l’œil à l’obscurité, la lumière
bactérienne
devient bien visible permettant même de lire les annotations
écrites
sur la boîte. Il est possible de prendre des photographies dans
une
chambre noire (100 ASA, pause B, f 5.6, durée d’exposition de 1
à 2 heures).
Voir les photographies des boîtes de culture de : Photobacterium
phosphoreum et Vibrio harveyi
Pour observer la luminescence en milieu liquide, 25 à 50 mL de milieu stérile contenus dans un ballon ou une fiole conique sont ensemencés stérilement avec un échantillon de culture sur milieu solide et l’embouchure du flacon recouverte d’un petit bécher. Après 24 h d’incubation à la température ambiante la luminescence peut être observée dans les mêmes conditions que précédemment. Si le flacon n’est pas agité, seule la surface du milieu en contact avec l’oxygène de l’air émet de la lumière car l’anaérobiose fait disparaître la luminescence. Après une agitation vigoureuse, l’ensemble du liquide émet de la lumière pendant quelques minutes jusqu'à épuisement du dioxygène dissous. A partir du moment où la luminescence devient visible, les cultures en milieu liquide peuvent être placées au réfrigérateur pendant quelques jours pour une utilisation ultérieure comme les cultures sur boîte. Lorsqu’elles sont sorties du réfrigérateur, il faut attendre le retour à la température ambiante pour observer la bioluminescence. Matériel Une chaîne d’acquisition informatisée a été utilisée pour mesurer la bioluminescence. Un luminomètre à phototube LKB Wallac 1250 obtenu à la suite d’une campagne de récupération de matériels obsolètes auprès de laboratoires, est utilisé pour mesurer l’émission lumineuse. Il est connecté à une interface d’acquisition ORPHY GTS pilotée par le logiciel-tableur REGRESSI reliée à un ordinateur PC fonctionnant sous MS DOS. L’ensemble de la chaîne d’acquisition a été obtenu auprès de la société MICRELEC. Résultats Cinétique de l’émission lumineuse 25 mL de milieu de culture ont été ensemencés la veille des mesures avec un échantillon de P. phosphoreum. Après une agitation vigoureuse du flacon de culture, 3 mL de la suspension bactérienne ont été placés dans une cuve standard introduite immédiatement dans la chambre de mesure. L’enregistrement a été poursuivi 7 minutes. La figure 1
montre le
tracé obtenu.
La bioluminescence se maintient à un niveau élevé pendant une minute puis décroît exponentiellement. La cinétique correspond à l’épuisement progressif du milieu en dioxygène dissous. Si la cuvette est agitée, on obtient de nouveau le même profil de luminescence. Au bout de 3 minutes, comme l’oxygène diffuse en permanence à l’interface air – liquide, seules les bactéries les plus proches de la surface continuent à émettre assurant un signal lumineux de niveau très faible. Ceci peut être vérifié visuellement dans une salle obscure. Intensité lumineuse et concentration en cellules Sur la figure 2
ont
été superposés les résultats obtenus pour
différentes
dilutions de la suspension mère (respectivement 3, 2.5, 2, 1.5,
1, 0.5, 0.2, 0.1, 0 mL de suspension bactérienne dans un volume
total de 3 mL).
Au cours de la première minute, l’émission lumineuse est très stable et l’intensité moyenne peut être lue directement sur le graphique et enregistrée. La valeur moyenne mesurée pour chaque dilution pendant une minute a été reportée sur un nouveau graphique en fonction du volume de suspension placé dans la cuve. La figure 3 présente les résultats obtenus.
L’intensité de l’émission lumineuse est inversement proportionnelle à la dilution avec un tracé presque parfaitement linéaire. L’émission lumineuse est directement proportionnelle au nombre de cellules bactériennes présentes dans la cuve tant que le dioxygène ne devient pas limitant. Préparation des tests Les substances à tester sont mises en solution dans le tampon (1 g.L-1) et sont diluées en fonction des besoins. La veille de chaque test, un flacon conique de 125 mL contenant 25 mL de milieu de culture est ensemencé à partir d’une boîte de la semaine. Le flacon est recouvert d’un petit bécher stérile et incubé 24 h. La culture est ensuite maintenue au réfrigérateur. Pour chaque substance testée, une courbe dose - réponse est construite et on détermine la concentration qui détermine une réduction de 50 % de l’émission lumineuse (Concentration inhibitrice 50 ou CI50. Celle-ci va de 0.008 ppM (parties par million) pour l’eau de Javel (hypochlorite de sodium) à quelques milliers pour les substances les moins toxiques. Les bactéries luminescentes peuvent aussi être utilisées pour d’autres usages, notamment pour étudier l’action de facteurs environnementaux. Les conditions optimales sont un pH de 7, une température entre 20 et 25°C, 3 % de NaCl et des conditions de culture aérobie. Résultats La figure 4 montre les résultats obtenus avec des concentrations croissantes d’acétate de plomb, les métaux lourds constituant un sérieux problème écologique.
On constate que la lumière émise par la suspension
bactérienne
décroît de façon grossièrement exponentielle
avec la concentration en sel de plomb. Pour une concentration de 500
ppM
(parties par millions), la luminescence est totalement abolie. La CI50,
concentration provoquant une diminution de 50 % de l’émission
lumineuse,
est égale à environ le dixième de la valeur
précédente
soit 50 ppM.
Conclusion Outre les observations et mesures qui relèvent de la
microbiologie
générale et n’ont pas été
développées
ici (croissance d’une population de micro-organismes, effet
d’antibiotiques
etc.) mais qui pourraient gagner à être menées avec
des bactéries luminescentes, la bioluminescence
bactérienne,
après celle de la luciole précédemment
explorée,
se révèle elle aussi riche d’applications
pédagogiques.
En mettant en œuvre à la fois des techniques classiques de la
microbiologie,
celles mises au point par Pasteur et Koch il y a plus d’un
siècle,
et des outils appartenant à ce qu’il est convenu d’appeler les
nouvelles
technologies, ce type d’activité présente de nombreux
avantages.
Parfaitement inséré dans les programmes officiels, il
permet
de concrétiser à la fois des objectifs cognitifs et
méthodologiques,
des savoir et des savoir-faire sur des sujets aussi divers que
l’énergétique
cellulaire et l’environnement en faisant directement appel à la
réalité biologique et au suivi de cultures. Il permet aux
élèves de pratiquer de réelles activités
scientifiques
qui se matérialisent par des mesures précises pour
résoudre
des problèmes dans un cadre d’investigation ouvert. Il
prépare
en outre les élèves à d’autres activités
prévues
dans le programme comme les cultures in vitro, les techniques
de
base de travail en conditions stériles restant les mêmes.
La bioluminescence en général et celle des
bactéries
en particulier n’ont pas encore livré tout leur potentiel
pédagogique.
D’autres expérimentations sont en cours pour mettre au point des
activités nouvelles susceptibles d’être mises en œuvre au
lycée sans difficulté majeure.
Bibliographie 1- Bulich A. & al. The luminescent bacteria toxicity test :
its
potential as an in vitro alternative. J. Bioluminescence
and
Chemiluminescence, 5, 1990.
RENSEIGNEMENTS PRATIQUES Pour se procurer des bactéries luminescentes Les bactéries luminescentes utilisées (Photobacterium phosphoreum et Vibrio harveyi) ont été obtenues auprès de la Collection de souches bactériennes de l’Institut Pasteur (souches 102511 T et 103192 T). Le prix de chaque souche est de 300 F. Il s’agit de bactéries non pathogènes pour l’homme utilisées au niveau scolaire dans plusieurs pays notamment pour l’étude de la bioluminescence. Collection de l’Institut Pasteur
On peut se procurer les mêmes espèces auprès du
Belgian
Coordinated Cultures of Microorganisms. Renseignements et commandes
par Internet :
Solutions 1- Milieu de culture (en grammes pour 1 L d’eau distillée) Bactotryptone 10
2- Tampon de dilution (pour 1 L) NaCl 30 g
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