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 Les enseignements des mutations de la couleur des yeux chez la drosophile, Drosophila melanogaster  


  • Un peu d'histoire
L’histoire de la génétique a connu plusieurs étapes majeures. Grégor Mendel a découvert en 1870 les lois de la génétique formelle en établissant les probabilités de transmission de tel ou tel trait des parents à la descendance en réalisant des croisements chez le pois. Entre 1910 et 1920, Thomas Morgan a établi la théorie chromosomique de l’hérédité en étudiant les résultats de croisements chez des mutants de la drosophile et les travaux menés avec cet organisme modèle ont conduit à définir le gène comme unité de fonction, unité de recombinaison et unité de mutation. Enfin, la découverte par Oswald Avery, en 1944, que les gènes sont formés d’ADN et l’élucidation de la structure de la molécule d’ADN par J. Watson et F. Crick, en 1953, rendirent possible la naissance d’une nouvelle génétique, la génétique moléculaire. Une des étapes cruciales de ces travaux fut la démonstration par G. Beadle, E. Tatum et J. Lederberg que les gènes s’expriment sous forme de protéines, notamment d’enzymes, ce que l’on résume par l’aphorisme « un gène, une enzyme ». Cette découverte, qui leur valut le prix Nobel en 1958, fut réalisée en travaillant sur des mutants de la moisissure Neurospora crassa. Mais pour s’attaquer à la question de savoir comment les gènes produisent leurs effets, ils travaillèrent initialement sur la couleur de l’œil de différents mutants de la drosophile Drosophila melanogaster. Beadle étudia ainsi 26 souches mutantes différant par la pigmentation des yeux. Avec B. Ephrussi, il mena de nombreuses expériences de transplantation de disque imaginaux des yeux entre différentes souches. Chez les insectes à métamorphoses complètes (holométaboles), comme les diptères, les organes de l’adulte ont pour origine le développement pendant la mue imaginale de disques imaginaux présents chez les larves. Ce sont ces expériences qui les conduisirent à formuler l’hypothèse que les gènes agissent par l’intermédiaire des enzymes. Toutefois, devant la complexité du système qui conduit à la pigmentation de l’œil de la drosophile, il préféra abandonner cet organisme pour en utiliser un plus simple, Neurospora crassa, ce qui le conduisit au succès. Néanmoins, certains des travaux menés sur les pigments de l’œil de la drosophile peuvent être utilisés au lycée pour illustrer diverses notions essentielles : en première S, celle des relations complexes entre génotype et phénotype ; en terminale S, celle de mutations et, en enseignement de spécialité, les notions liées à l’histoire de la génétique. Enfin, l’utilisation de la chromatographie pour séparer les pigments est l'occasion de souligner l’importance des progrès techniques dans le développement des connaissances scientifiques.
  • Les pigments des yeux de la drosophile
Les yeux des drosophiles de souche sauvage contiennent plusieurs pigments appartenant à deux familles chimiques différentes, la famille des ptéridines, de couleur jaune à rouge, et celle des ommochromes, de couleur brune.
Les pigments de la famille des ptéridine dérivent par diverses transformations enzymatiques de la guanosine triphosphate (GTP). Ceux de la famille des ommochromes dérivent de l'acide aminé tryptophane.
La production des deux groupes de pigments est sous le contrôle de deux chaînes de biosynthèse séparées comportant chacune plusieurs enzymes (voir figure). En outre, certaines réactions de condensation de ces chaînes de biosynthèse ne sont pas enzymatiques. Enfin, la chaîne de biosynthèse des ptéridines comporte plusieurs branches, ce qui complique quelque peu la mise en relation d’un phénotype avec telle ou telle mutation.
Chez la souche sauvage, c’est le mélange de différentes ptéridines, intermédiaires de la chaîne de biosynthèse et produits finaux, comme la drosoptérine, rouge-orange, avec la xanthommatine, brune, le produit final de la chaîne de biosynthèse des ommochromes, qui conduit à la couleur rouge brique de l’œil : le pigment brun atténue la couleur rouge vif due au mélange de ptéridines.


Tête de drosophile
(souche sauvage, yeux de couleur rouge brique)

C'est pourquoi, chez les mutants de la série rouge, comme vermilion, scarlet et cinnabar, les mouches ont l’œil rouge vif : la chaîne de biosynthèse des ommochromes est interrompue à différents niveaux et le pigment brun n'est pas synthétisé. En son absence, la couleur rouge vif des ptéridines n'est plus atténuée et l'oeil a une couleur rouge plus vive que chez la souche sauvage (rouge brique).
Au contraire, chez les qui ont les yeux bruns, comme brown, la chaîne de biosynthèse des ptéridines est interrompue dès le départ et l'oeil est dépourvu de ptéridines. Seul le pigment brun est présent dans l'oeil lui conférant donc une couleur brune.
Les mutants appelés sepia présentent une mutation qui interrompt la chaîne de biosynthèse des ptéridines à une étape qui empêche la production de la drosoptérine. La chaîne de biosynthèse conduit alors uniquement à la production d'intermédiaires, des ptéridines qui sont minoritaires dans la souche sauvage, et à la sepiaptérine, un pigment jaune. Le mélange de ces ptéridines avec la xanthommatine, brune, conduit à des yeux de couleur sépia.
Enfin, les mutants qui ne synthétisent aucun pigment, ni ptéridines, ni ommochromes, ont les yeux blancs (white).



Mutant scarlet
(phénotype [st] ; génotype st//st)
Mutant brown
(phénotype [bw] ; génotype bw//bw)


Mutant sepia
(phénotype [se] ; génotype se//se)
Mutant aux yeux blancs
(phénotype [w] ; génotype Xw//Xw ou Xw//Y)
Quelques mutants de la couleur des yeux

La situation se complique toutefois du fait que le précurseur des ptéridines, le GTP, de même que le précurseur des ommochromes, le tryptophane, doivent être transportés activement dans les cellules pigmentaires de l’œil par des protéines membranaires de transport (appartenant à la famille des transporteurs dits "ABC", ATP Binding Cassette) pour alimenter chacune des deux chaînes de biosynthèse. Or ces protéines membranaires assurant le transport des précurseurs sont des hétérodimères. En d'autres termes, elles sont formées de deux sous-unités protéiques différentes, ce qui signifie que chacune de ces deux sous-unités est codée par un gène différent. La protéine de transport du tryptophane est formée par l’association de la protéine white avec la protéine scarlet tandis que la protéine de transport du GTP est formée par l’association de la protéine white avec la protéine brown. Une mutation affectant la protéine white conduit donc à l’absence des deux types de pigments et à des yeux blancs, comme on l’a vu, puisqu’aucun des précurseurs n’est transporté dans l’œil. Mais les doubles mutants, brown et scarlet,  présentent également des yeux blancs puisqu’aucun des deux transporteurs n’est fonctionnel, chacun d'entre eux ayant une des deux sous-unité non fonctionnelle.

Mutant aux yeux blancs
(génotype double mutant bw, st//bw, st)

Ainsi, une mouche peut avoir les yeux blancs, soit parce qu’elle présente une mutation dans le gène de la protéine white, soit parce qu’elle possède une double mutation, l’une dans le gène de la protéine brown, l’autre dans le gène de la protéine scarlet. En revanche, si seul le gène scarlet est muté, c’est seulement le transport du tryptophane qui ne se produit pas et il n’y a pas synthèse de pigment brun, ce qui conduit à un œil rouge vif.
Il faut noter que l’ensemble de ces allèles mutants étant récessifs, seuls les homozygotes présentent le phénotype mutant.
Enfin, il faut se souvenir que les noms des mutants ont été initialement donnés en se référant à leur phénotype visible (la couleur des yeux) et non à l’enzyme rendue inactive par la mutation. C’est pourquoi les noms des mutants ne correspondent ni au gène muté, ni à l’enzyme correspondante.
Les chaînes de biosynthèse des deux pigments sont représentées ci-dessous :



Chaîne de biosynthèse des pigments des yeux de la drosophile
Chez la souche sauvage, la couleur de l'oeil résulte essentiellement du mélange de la xanthommatine, de couleur brune et de la drosoptérine, de couleur rouge-orange.
 
La chaîne de biosynthèse des ommochromes est linéaire. Elle comporte quatre enzymes principales et conduit à la production de deux molécules de 3-hydroxycynurénine qui se condensent en hydroxanthommatine. Sa déshydrogénation conduit au pigment brun,  la xanthommatine.
La chaîne de biosynthèse des ptéridines est ramifiée. Elle comporte huit enzymes principales et conduit à la production de sept ptéridines différentes toutes présentes dans l’œil des drosophiles sauvages, mais c'est la drosoptérine qui est majoritaire.
Une mutation affectant un gène codant l’une des enzymes de la chaîne des ptéridines va se traduire, si l’enzyme résultante est inactive, par une réduction de la diversité des ptéridines et donc par une modification de la couleur de l’œil vers le brun. Inversement, une mutation affectant un gène codant l’une des enzymes de la chaîne des ommochromes va se traduire par l’absence de xanthommatine, le pigment brun, et la couleur de l’œil sera rouge vif. Ainsi, scarlet signifie écarlate, vermilion, vermillon tandis que cinnabar signifie cinabre, un sulfure de mercure de couleur rouge.
On peut identifier les pigments de la chaîne des ptéridines après séparation par chromatographie, sur papier ou sur couche mince. En mettant en relation les résultats de la chromatographie avec les informations fournies par la chaîne de biosynthèse, on peut essayer d’en déduire quelles sont les enzymes inactives chez les différents mutants et donc identifier les gènes correspondants. Ceci permet de comprendre, non seulement comment différents génotypes sont à l’origine de différents phénotypes chez la drosophile, mais aussi de distinguer la notion de phénotype moléculaire (modification d’une seule protéine enzymatique due à une mutation) de celle de phénotype macroscopique (couleur de l’œil d’origine plurifactorielle due à un mélange de pigments). On peut également montrer ainsi qu’un même phénotype peut résulter de génotypes différents, comme dans le cas de l’œil blanc, démontrant ainsi que des génotypes différents conduisant à des phénotypes moléculaires différents peuvent néanmoins correspondre à des phénotypes identiques au niveau des cellules et au niveau de l’organisme.
  • Séparation des pigments par chromatographie
    • Matériel
  • Papier à chromatographie (Whatman N°1) ou plaques de gel de cellulose.
  • Solution de développement : mélange isopropanol – ammoniaque à 1 % (1:1 v à v).
  • Grandes pinces pour manipuler le papier.
  • Pinces fines pour manipuler les mouches.
  • Règle et crayon à papier.
  • Cuve à chromatographie (flacon cylindrique en verre de dimensions adaptées à la feuilles ou bécher d’environ 15 cm de haut et 10 cm de diamètre).
  • Papier d’aluminium.
  • Papier essuie-tout.
  • Lampe à UV (340 nm).
  • Agitateurs en verre (diamètre 4 mm).
  • Drosophiles sauvages et mutants de la couleur des yeux (sauvage [+], white [w], sepia [se], brown [bw], scarlet [st],  brown et scarlet [bw, st]).
  • Protocole
Préparation des cuves à chromatographie
Mener les opérations suivantes si possible sous une hotte. Éviter de respirer les vapeurs de solvants.
Le solvant doit être placé dans les cuves avant la séance, pour que l’atmosphère du flacon ait le temps de se saturer en vapeurs de solvant.
Verser un volume suffisant de solvant de développement au fond du flacon pour que la hauteur du liquide soit d’environ 1 cm (une fois le papier mis en place, le niveau du liquide devra se situer à environ 1 cm en dessous du trait de crayon, sans atteindre les dépôts). Fermer hermétiquement le flacon avec un couvercle étanche.

Préparation des bandes de papier

Deux méthodes sont possibles selon le type de cuve à chromatographie dont on dispose. S’il s’agit de cuves avec un bouchon équipé d’un crochet coulissant permettant de suspendre la bande, découper des bandes de 15 cm de long x 7 cm de large (selon le diamètre de la cuve).
Si on ne dispose que de flacons ordinaires, comme des grands béchers (au moins 15 cm de haut et 10 cm de diamètre), découper des bandes de 15 cm x 20 cm qui seront formées en cylindre et agrafées avant d’être posées au fond de la cuve.
Dans tous les cas, éviter de toucher le papier avec les doigts lors des manipulations. On peut, le cas échéant, utiliser des gants. Manipuler le papier avec des pinces.
Poser la bande sur une grande feuille de papier.
Tirer un trait avec un crayon à papier, perpendiculairement au côté étroit du papier, à environ 1,5 cm du bord. Sur le trait, tracer des croix espacées de 1,5 cm pour matérialiser l’emplacement des dépôts. Noter le symbole correspondant à chaque phénotype en face de chaque croix à l’autre extrémité du papier.

Préparation des mouches

Il importe de procéder avec rigueur et ordre pour ne pas risquer de mélanger des mouches de souches différentes.
Tuer les drosophiles de chaque phénotype à étudier, soit en les mettant dans un flacon contenant un tampon imbibé d’éther, soit en les mettant dans un flacon au congélateur. Il faut au moins trois drosophiles du même phénotype pour chaque dépôt, mais pour obtenir de meilleurs résultats, on peut en utiliser jusqu’à cinq ou six.
Transférer les mouches dans des tubes à hémolyse étiquetés avec le nom de la souche et fermés. On dispose ainsi d’autant de tubes que de souches.

Dépôts des échantillons

Faire tomber deux ou trois mouches de la souche sauvage sur la feuille du chromatogramme.
Avec une pince fine, saisir la drosophile par l’abdomen ou les ailes et la maintenir au niveau de la première croix dessinée sur le papier ou la plaque et écraser la tête avec l’extrémité de l’agitateur. Éliminer le reste du corps et bien nettoyer l’agitateur entre chaque souche différente ou en utiliser un différent pour chaque phénotype.
On peut également décapiter les mouches au préalable et écraser directement la tête avec l’agitateur. Continuer de la même façon à l’emplacement suivant avec une mouche du phénotype prévu. Procéder ainsi pour chaque dépôt en n’écrasant à chaque fois qu’une ou deux têtes. Refaire la même série de dépôts au moins deux fois (4 mouches) ou trois fois (six mouches) aux mêmes emplacements, en prenant soin de ne pas mélanger les mouches de phénotypes différents et de ne pas se tromper d’emplacement.

Développement du chromatogramme

Mener les opérations suivantes sous une hotte.
Mettre en place le papier en veillant bien à ce que le liquide n’atteigne pas les dépôts. S’il s’agit d’une cuve avec un bouchon équipé d’un crochet coulissant permettant de suspendre la bande, accrocher la bande au crochet relevé au maximum, l’introduire dans la cuve, boucher la cuve avec le bouchon et régler la hauteur du crochet pour que l’extrémité inférieure de la bande trempe dans le solvant en restant séparé d’environ 1 cm de la ligne des dépôts.


Développement du chromatogramme

Sinon, rouler le chromatogramme en cylindre et agrafer le haut et le bas, puis déposer le cylindre dans le flacon.
Recouvrir le flacon avec du papier d’aluminium pour protéger de la lumière les pigments qui sont photosensibles.
Laisser le solvant migrer jusqu’à ce que le front du solvant soit à environ 1 cm de l’extrémité supérieure du papier, soit environ 2 heures de développement.
Retirer la bande de papier, la déposer sur une feuille de papier essuie-tout et marquer l’emplacement du front du solvant et des taches visibles à l’œil nu. Recouvrir la bande de papier d’aluminium (les pigments sont photosensibles) et laisser sécher.
  • Résultats

Observer d'abord les résultats en lumière visible et marquer avec un crayon à papier le front des quelques pigments visibles, essentiellement chez les mouches sauvages, scarlet et sepia.


Chromatogramme photographié en lumière visible

Placer ensuite le chromatogramme développé sous la lampe UV. Ne pas regarder directement la lumière UV ! Les différentes ptéridines sont fluorescentes en lumière ultraviolette (orange, bleu et jeune chez les sauvages et scarlet ; jaune et bleu chez sepia, rien chez les autres, w, bw st). Les pigments ommochromes (bruns) ne migrent pas avec cette technique et restent sur la ligne de dépôt.


Chromatogramme photographié en lumière ultraviolette
 
En lumière visible, on observe la présence d'un pigment orange qui migre peu, la drosoptérine, uniquement chez les mouches de génotype sauvage (+) et scarlet (st) ainsi qu'une faible quantité de pigment jaune, la sépiaptérine. Les ptéridines présentes chez les mouches sauvages et scarlet sont les mêmes.Chez les mouches de génotype sépia (se), seule la sépiaptérine est détectable en lumière visible ; aucune ptéridine n'est détectable dans le visible chez les mouches de génotype brown (bw), white (w) et brown & scarlet (bw, st).
En lumière ultraviolette, les mouches sepia montrent une bande intensément fluorescente, très claire, correspondant à la sepiaptérine, surmontée d'une bande bleue correspondant correspondant à l'isoxanthoptérine alors que chez les mouches de génotype sauvage et scarlet , la sépiaptérine et l'isoxanthoptérine sont beaucoup moins abondantes et qu'on observe aussi d'autres pigments fluorescents correspondant à des intermédiaires absents ches les sépia. Comme dans le visible, aucune ptéridine n'est détectable chez les mouches de génotype brown, white et brown & scarlet.
Chaque souche mutante pour la couleur des yeux est dépourvue de tel ou tel pigment ou groupe de pigments, ce qui peut être mis en relation avec les enzymes et les gènes correspondants en se référant au schéma des voies de biosynthèse ci-dessus.
  • Interprétation
Toutes les mouches utilisées sont homozygotes pour les mutations étudiées, à l'exception des mâles white qui sont hémizygotes Xw//Y puisque la mutation w est portée par le chromosome X.
Les mouches st//st (scarlet) sont déficientes en l'une des deux sous-unités constituant la protéine de transport du tryptophane. La voie de biosynthèse du pigment brun, la xanthommatine, est inactive et seule la voie des ptéridines est présente, ce qui explique que le chromatogramme des st//st soit identique à celui des sauvages.
Chez les mouches se//se (sepia), l'enzyme PDA synthase est inactive, empêchant la synthèse de la drosoptérine. Aussi, la voie de biosynthèse conduisant à la sépiaptérine et à l'isoxanthoptérine à partir du 6-PTP (bioptérine) est la seule à pouvoir fonctionner et ces deux pigments sont les seuls à s'accumuler de manière significative dans les yeux. Associés au pigment brun (xanthommatine), ils donnent aux yeux leur couleur sépia.
Chez les mouches bw//bw, l'une des deux sous-unités constituant la protéine de transport du GTP est déficiente. En l'absence du précurseur des ptéridines, aucun de ces pigments ne peut être synthétisé, et seule la xanthommatine colore les yeux en brun.
Chez les mouches w//w, une des deux sous-unités (la protéine white) constituant tant la protéine de transport du GTP (brown + white) que la protéine de transport du tryptophane (scarlet + white) est déficiente. En l'absence de précurseur de chacune des deux voies, ptéridines comme ommochromes, aucun pigment ne peut être synthétisé et les yeux sont blancs.
Il en est de même chez les mouches st, bw//st,bw, puisque là encore, une des deux sous-unités (la sous-unité brown de la protéine de transport du GTP brown + white et la sous-unité scarlet de la protéine de transport du tryptophane scarlet + white) est déficiente. En l'absence de précurseur de chacune des deux voies, ptéridines comme ommochromes, aucun pigment ne peut être synthétisé et les yeux sont blancs, comme chez les mutants white
  • Fournisseur
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