 | Dénombrement des cellules dans une suspension de microorganismes
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On a souvent besoin lors de manipulations ou d'expériences de
microbiologie de déterminer
le nombre de cellules présentes dans une culture, tant sur
milieu solide qu'en suspension dans un milieu liquide. Il peut s'agir
de bactéries, de levures, d'algues unicellulaires, etc. En
particulier, un tel dénombrement est indispensable lors
d'expériences portant sur le métabolisme cellulaire pour
déterminer le nombre de molécules consommées ou
produites (glucose, oxygène, dioxyde de carbone, etc.) par une
seule cellule, par exemple par respiration, fermentation ou
photosynthèse.
Diverses méthodes
sont envisageables : la numération sur lame (cellules de Malassez, lames à numération jetables),
les dilutions en série suivies d'étalement sur milieu solide ou
la turbidimétrie avec un spectrophotomètre. Ces méthodes
peuvent s'appliquer tant aux microorganismes procaryotes, comme les bactéries,
qu'aux microorganismes eucaryotes, comme les levures ou les algues unicellulaires.
Nous
présentons ici une méthode turbidimétrique
adaptée au suivi de cultures en milieu liquide. Cependant, comme
l'étalonnage est fondé sur la numération avec une
lame à numération jetable, on peut aussi faire
directement des dénombrements sur des échantillons
prélevés à des moments choisis si on ne dispose
pas de spectrophotomètre. On peut aussi suivre la croissance de
colonies sur milieu solide en réalisant les mesures sur des
suspensions obtenues à partir d'une seule colonie.
Les mesures présentées ici ont été
réalisées avec des levures mais les méthodes sont
les mêmes pour tous les les microorganismes, protistes,
bactéries, algues unicellulaires.
Levures Saccharomyces cerevisiae
(X 1000, objectif à immersion)
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Levures Schizosaccharomyces pombe
(X 600 dans une chambre de comptage de lame à numération)
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Chlorelles (algues unicellulaire)
(X 1000, objectif à immersion)
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Paramécie (protiste cilié)
(X 250)
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Quelques microorganismes susceptibles d'être dénombrés en culture
(microscope optique, sans coloration)
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Principe de la mesure turbidimétrique
Lorsque des cellules sont en suspension dans un milieu liquide traversé
par un faisceau lumineux monochromatique, la quantité de lumière
absorbée et dispersée par la suspension dépend de la concentration
des cellules et de leur taille. La relation entre absorbance et concentration en cellules
est linéaire dans une gamme de concentrations couvrant environ un
ordre de grandeur.
Si on connaît la droite représentant l'absorbance de la
suspension en fonction de la concentration en cellules, il suffit de
mesurer l'absorbance d'une suspension de concentration inconnue pour
déterminer graphiquement le nombre de cellules qu'elle contient.
En partant d'une suspension contenant un nombre de cellules connu,
on peut aisément construire cette droite, appelée droite
étalon. Pour cela, on réalise une gamme de dilutions
déterminée de la suspension connue et l'absorbance de
chaque
dilution est mesurée avec un spectrophotomètre. La droite
Absorbance
= f (concentration en cellules) est alors construite.
Pour déterminer
la concentration en cellules d'une suspension de concentration
inconnue, on mesure l'absorbance d'un échantillon, après
dilution si nécessaire, et on reporte la valeur obtenue sur la
droite
d'étalonnage pour en déduire sa concentration.
Pour connaître la concentration
en cellules de la suspension servant à construire la droite d'étalonnage
on la détermine au préalable avec
une lame à numération (cellule de Malassez ou lame à
numération jetable).
La numération sur lame peut aussi être utilisée
directement sur des échantillons prélevés aux
moments voulus.
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Préparer une suspension de levure de boulanger (levure fraîche)
à 0,1 g/100 mL.
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Prélever un échantillon de la suspension avec une pipette
Pasteur.
- Remplir
la chambre de comptage d'une lame à numération en
plaçant l'extrémité de la pipette contre l'encoche
de la lamelle et en laissant le liquide passer par capillarité
dans la chambre.
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Au grossissement moyen du microscope, faire la mise au point sur la grille
et compter le nombre de cellules présentes dans un carré.
Si ce nombre est trop élevé, faire une dilution, par exemple
au 1/10 et refaire une numération.
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Déterminer le nombre de cellules par unité de volume en suivant
les spécifications données par le fabricant (pour une lame Kova :
multiplier le nombre de cellules par carré élémentaire
par 90 pour obtenir le nombre de cellules par µL).
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| Lame à numération KOVA |
Détail d'une chambre de comptage |
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Carré unité d'une chambre de comptage
Microscope optique X 400
(cellules de la levure S. pombe)
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Construction de la droite d'étalonnage
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Régler le spectrophotomètre sur une longueur d'onde rouge
(630 nm par exemple) et déterminer le zéro d'absorbance avec
une cuve remplie d'eau.
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Réaliser une série de dilutions de la suspension initiale
(1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16). Il est plus simple de faire les dilutions directement
dans des cuves standards de spectrophotomètre en suivant par exemple
le tableau ci-contre qui s'applique à une suspension de levures de
boulangerie à 1g/L (0,1 g/100 mL).
Utiliser de l'eau physiologique (NaCl à 9 g/L) comme liquide
de dilution et bien agiter chaque cuvette avant la mesure.
- Mesurer l'absorbance de chaque cuvette.
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Construire le graphique Absorbance = f [cellules]
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Volume de la
suspension mère
(mL)
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Volume d'eau
physiologique
(mL)
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3
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0
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1,5
|
1,5
|
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0,75
|
2,25
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0,375
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2,625
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0,187
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2,812
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Droite d'étalonnage : Absorbance =
f [cellules]
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Détermination de la concentration
en cellules dans une culture
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Prélever un échantillon de la culture.
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En fonction de son aspect, faire éventuellement une dilution (comparer
avec les cuvettes ayant servi à construire la droite d'étalonnage).
- Mesurer l'absorbance de l'échantillon.
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Reporter l'absorbance mesurée sur la droite et lire la concentration
sur l'axe des abscisses.
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Corriger de la dilution éventuelle du prélèvement.
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Détermination graphique de la concentration
Valeur lue : absorbance = 0,54 correspondant à 3 500 cellules par microlitre
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Fournisseur
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Lames de numération KOVA-SLIDE
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Levures, algues, protistes
SORDALAB
Parc Sudessor
15 avenue des Grenots
91150 Etampes
Tel : 01.69.92.26.72
Fax : 01.69.92.26.74
sordalab@wanadoo.fr
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