Protocole
Réalisation de préparations microscopiques de mitose

  • Introduction

La mitose ou division cellulaire est un mode de reproduction asexuée des cellules eucaryotes permettant leur multiplication.  Elle conduit, à partir d'une cellule mère, à la formation de deux cellules filles identiques génétiquement, entre elles et avec la cellule mère, car au cours de ce processus, les chromosomes de la cellule mère sont dupliqués et répartis également entre les cellules filles. Chez les organismes pluricellulaires, c'est le principal facteur responsable de la croissance des tissus.
Pour observer aisément les différentes phases de la mitose et les chromosomes, il est préférable d'utiliser de jeunes organes en croissance dans lesquels les mitoses sont nombreuses. En outre, les cellules végétales étant généralement plus grosses que les cellules animales et donc plus faciles à observer au microscope et l'utilisation d'organes végétaux ne soulevant pas de problèmes éthiques, il est aussi préférable d'utiliser des organes végétaux. Un matériel biologique particulièrement adapté, facile à obtenir et peu coûteux est constitué par les jeunes racines obtenues à la base de bulbes de diverses plantes (ail, oignon, échalote, jacinthe).
  • Préparation
Pour obtenir le développement des racines en quelques jours (généralement 2 à 5 jours), il suffit de placer les bulbes quelques jours avant la manipulation sur un récipient rempli d'eau de façon à ce que le plateau du bulbe (sa base) baigne dans l'eau. Pour maintenir un niveau d'eau suffisant en dépit de l'évaporation,  il suffit de rajouter chaque jour un peu d'eau dans les flacons.
La photographie ci-dessous montre le résultat obtenu en quelques jours pour différents bulbes.
La croissance des racines est rapide, de l'ordre de quelques mm par jour. Elle résulte des mitoses qui se produisent dans le méristème racinaire, zone de croissance située dans la zone sub-apicale de la racine.


Bulbes d'oignon, d'ail et d'échalottes après croissance des racines

Le méristème forme une petite tâche visible à l’œil nu, proche de l'extrémité des racines, comme on le voit dans le cliché ci-dessous. C'est la région qu'il convient de prélever pour réaliser la préparation.


  • Protocole
1. Prélever avec des ciseaux une jeune racine en croissance sur un bulbe. Couper le segment terminal à 5 mm de l'extrémité et le déposer sur une lame porte-objet. On doit observer près de l'extrémité le méristème qui forme une petite tache.
Plus le fragment prélevé est petit, dans l'idéal limité au méristème, plus le rapport du nombre de cellules en mitose par rapport au nombre total de cellules est élevé, facilitant ainsi l'identification des figures de mitose dans la préparation microscopique finale.

2. Recouvrir l'échantillon d'acide chlorhydrique à 1 mol.L-1. Laisser agir 5 minutes pendant lesquelles l'acide hydrolyse le ciment pectique qui relie les parois cellulaires. Ceci facilitera ensuite la dissociation des cellules.

3. Enlever l'acide avec un essuie tout utilisé comme papier buvard en faisant attention de ne pas coller l’échantillon sur le papier.

4. Recouvrir l'échantillon d'une solution d'orcéine et laisser agir pendant 20 minutes.
 


5. Éliminer le colorant avec un essuie tout en faisant attention de ne pas entraîner l'échantillon.
6. Recouvrir d'une goutte d'acide acétique à 45 % et poser une lamelle couvre-objet.

7. Appuyer doucement sur la lamelle (attention, fragile !) pour aplatir l'échantillon de façon à former une couche monocellulaire en déplaçant légèrement la lamelle tout en appuyant pour provoquer la dissociation des cellules.


  • Résultats
L'identification des figures de mitose nécessite d'explorer soigneusement l'ensemble de la préparation car les cellules sont dissociées à la suite des traitements subis et le nombre de cellules en division par rapport au nombre total de cellules est faible.
Les clichés ci-dessous ont été réalisés avec un grossissement du microscope x 400 et un zoom numérique x 2. Ils présentent dans l'ordre chronologique du déroulement les phases caractéristiques de la mitose, prophase, métaphase, anaphase, télophase. La plupart des clichés montrent aussi des cellules en interphase.


Interphase (en bas) et prophases


Interphase (à gauche) et métaphase


Anaphase (à gauche) et interphase

Télophase

  • Solutions

Acide chlorhydrique 1 mol.L-1 
Dans une fiole jaugée de 1 L, verser 914 mL
d’eau distillée.
Compléter à 1 L avec de l’acide chlorhydrique
 à 36 % (densité 1,178).
Orcéine acétique, solution mère 
Dissoudre 1 g d’orcéine dans 45 mL
d’acide acétique pur. 
Faire bouillir jusqu’à dissolution et laisser refroidir.
Filtrer et conserver le filtrat au réfrigérateur.

Solution diluée à préparer extemporanément 
Mélanger 9 mL de solution mère avec 11 mL
d’eau distillée et répartir dans des flacons compte-gouttes.
  • Fournisseur
Orcéine :
SIGMA
L’Isle d’Abeau Chesnes, BP 701 38297 Saint Quentin Fallavier Cedex 
Téléphone : 04 74 82 28 00

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