3Extraction de l'ADN de l'archéobactérie halophile Halobacterium salinarum

Protocole

Extraction de l'ADN de l'archéobactérie halophile Halobacterium salinarum

Introduction
Protocole
Résultats

Autres activités et protocoles avec H. salinarum :

Introduction

Le génome de Halobacterium salinarum comporte trois unités circulaires ou réplicons : un grand chromosome et deux plasmides. La lyse rapide des cellules dès qu'elles sont placées dans l'eau ou dans une solution faiblement concentrée, rend l'extraction de l'ADN particulièrement aisée, ne nécessitant aucun broyage, contrairement aux cellules munies d'une paroi, comme les cellules végétales ou les levures. En comparant la "méduse" obtenue avec celles obtenues avec des organismes eucaryotes ou avec d'autres microorganismes ou en la colorant avec des colorants spécifiques de l'ADN, on peut montrer que l'ADN, support chimique de l'information génétique, est universel. La manipulation est extrêmement simple, ne requiert aucun matériel particulier et ne nécessite que de l'éthanol glacial. L'ADN obtenu peut aussi être utilisé pour mener une électrophorèse sur gel d'agarose.

Protocole

Démarrer une culture sur milieu solide (ou utiliser une culture faite au préalable pour d'autres objectifs) de façon à obtenir un tapis de bactéries.
Pour cela, étaler soigneusement avec un rateau sur toute la surface d'une boîte de milieu de culture solide trois gouttes d'une culture en milieu liquide riche en cellules ou prélever trois gouttes après avoir mis en suspension quelques colonies dans quelques gouttes de milieu liquide.
Placer la boîte dans un sachet étanche pour éviter l'évaporation et laisser incuber la boîte retournée, couvercle vers le bas, pendant deux semaines à la température ambiante ou pendant une semaine à l'étuve entre 35 et 42°C.
L'aspect de la boîte sera alors similaire à ce que l'on peut voir sur le cliché ci-dessous :

Tapis de Halobacterium salinarum sur milieu solide

Verser alors environ 5 mL d'eau du robinet à la surface de la boîte et recouvrir entièrement le tapis avec l'eau en inclinant légèrement la boîte de tous les côtés.
Attendre au moins trois minutes pour laisser les cellules se lyser.
Attention, les molécules d'ADN sont très fragiles et pour récupérer plus facilement les filaments d'ADN, dont le diamètre est d'environ 2 nm, il faut éviter de les briser. Il convient donc de manier avec précaution la solution pour minimiser les ruptures.
Décoller doucement à l'aide d'un râteau (étaleur) les cellules qui adhèrent encore au milieu de façon à ce que toutes les cellules se retrouvent dans le liquide.
Verser à l'aide d'un entonnoir le liquide épais dans un tube à essai d'au moins 10 mL de volume.
En tenant le tube à 45 °, verser environ 5 mL d'éthanol ou d'isopropanol glacial, très lentement, le long de la paroi du tube .
Laisser ensuite reposer le tube pendant environ 30 minutes.

Résultats

Progressivement, l'ADN qui est insoluble dans l'alcool précipite et se sépare du lysat cellulaire en remontant vers la surface comme on peut le voir ci-dessous :


Deux étapes de la séparation progressive de l'ADN du lysat cellulaire. Il se forme une "méduse" d'ADN

La "méduse" d'ADN peut alors être récupérée en entourant les filaments à l'extrémité d'une pipette Pasteur boutonnée ou d'un cure-dents en bois.
La méduse peut ensuite être dissoute dans un tampon approprié pour mener une électrophorèse sur gel d'agarose.

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