Résistance à la dessiccation et au sel chez l'archéobactérie halophile Halobacterium salinarum 

Autres activités et protocoles avec H. salinarum :

Introduction

Les halobactériacées sont des archéobactéries qui se développent dans des milieux hypersalés, c'est à dire dont la concentration en chlorure de sodium dépasse celle de l'eau de mer. On parle en effet de milieu hypersalé dès que la concentration en sels totaux dépasse celle de l’eau de mer, c’est à dire lorsqu’elle est supérieure à environ 35 g/L. La concentration optimale en sel pour Halobacterium salinarum et les espèces proches est de 4,6 mol.L-1, près de dix fois celle de l’eau de mer. Elle est donc proche de la saturation qui intervient vers 5,2 mol.L-1, environ 300 g/L, selon la température. De façon étonnante, lorsque la saturation intervient et que le sel cristallise, les cellules emprisonnées dans les cristaux de sel ne meurent pas et les cristaux peuvent être utilisés pour ensemencer un milieu de culture. Cette propriété peut être aisément explorée en classe.

Pour la plupart des cellules, la pression osmotique développée par une concentration élevée en sels est incompatible avec leur survie car le sel « pompe » littéralement l’eau intracellulaire vers le milieu extracellulaire. Cette propriété est d'ailleurs mise à profit pour conserver des aliments dans la saumure ou par salaison. Quelques organismes sont halotolérants car ils sont pourvus de divers mécanismes permettant d’empêcher la fuite d’eau, par exemple une concentration intracellulaire importante en solutés tels que le glycérol, mais Halobacterium utilise un mécanisme différent. De plus, il a un besoin absolu d’une concentration élevée en sel, en particulier pour maintenir la structure de sa membrane et de ses protéines et ne peut se multiplier si la concentration en sel est inférieure à 2,5 mol.L-1. Halobacterium salinarum équilibre sa pression osmotique intracellulaire par rapport à celle du milieu extracellulaire en accumulant activement des ions potassium (K+) à une concentration proche de 5 mol.L-1. Il accumule aussi activement les ions chlorures. Cette accumulation est rendue possible par l'activité de protéines transmembranaires (canaux potassium, canaux chlorures) dont l’une est une pompe à chlorures activée par la lumière, appelée halorhodopsine. Si ce dispositif permet d’empêcher la fuite d’eau, il devrait cependant soumettre la cellule à un sévère stress salin car les protéines sont insolubles dans un milieu aussi concentré en sels, propriété aisée à mettre en évidence expérimentalement.

Action du sel sur une protéine banale

À une concentration de l’ordre de 5 mol.L-1, concentration intracellulaire de Halobacterium salinarum, la plupart des protéines précipitent et ne peuvent dès lors remplir leurs fonctions. En effet, la structure tertiaire des protéines qui conditionne leurs fonctions, est étroitement dépendante des interactions avec les molécules d’eau présentes à leur surface, ce que l’on appelle la couche d’hydratation. Aussi, lorsqu’une protéine soluble est placée dans une solution de NaCl ou de KCl proche de la saturation, les molécules d’eau piégées par le sel ne peuvent plus interagir avec les acides aminés présents à la surface de la molécule, entraînant ainsi la déstabilisation de la conformation native de la protéine qui devient insoluble et précipite. Pour montrer l’action d’une forte concentration en sel sur une protéine soluble banale et abondante, on peut utiliser l’albumine du blanc d’œuf de poule, pourtant particulièrement résistante à une concentration élevée en sel.

Protocole
 Filtrer un blanc d’œuf sur une gaze pour éliminer les chalazes.
Compléter le volume à 50 mL avec de l’eau distillée et mélanger doucement, avec un agitateur en verre, sans faire de mousse, pour obtenir une solution homogène.
Répartir quelques mL de cette solution dans deux tubes.
Compléter le premier avec un excès de solution de NaCl à saturation et le second avec une solution de NaCl moins concentrée.

Résultats
On constate d'abord l’apparition d’un trouble dans le premier tube, traduisant la dénaturation progressive de l’ovalbumine, tandis qu’il ne se passe rien dans le second. Après quelques heures, toutes les molécules d’ovalbumine ont été dénaturées et elles sédimentent en formant un culot au fond du premier tube.



Début de dénaturation
 Sédimentation du culot d'ovalbumine dénaturée

Les protéines halophiles

Les bactéries halophiles synthétisent des protéines qui concentrent près de 10 % de leur poids en KCl près de la surface de la molécule, ce qui permet d’y piéger les molécules d’eau nécessaires au maintien de leur configuration spatiale et à leur solubilité dans l’eau. La surface de ces protéines est en quelque sorte recouverte d’une pellicule formée de sels et d’eau qui les stabilise et, si la concentration en KCl devient insuffisante, elles se dénaturent. Chez les bactéries halophiles extrêmes, ce sont donc les protéines elles-mêmes qui sont halophiles et elles ne peuvent pas fonctionner en l’absence d’une concentration élevée en sel. En outre, ces protéines sont stabilisées par des ponts salins. Il en est de même pour les liaisons entre sous-unités des édifices protéiques à structure quaternaire. La détermination de la séquence de plusieurs de ces protéines et la prévision de leur structure tridimensionnelle par le calcul a montré qu’elles diffèrent de leurs homologues non halophiles par une grande abondance d’acides aminés acides (acides glutamique et aspartique) situés en surface, donnée confirmée par les résultats du séquençage du génome de Halobacterium et par l’établissement de la structure tertiaire de quelques protéines halophiles par cristallographie. La proportion d'acides aminés acides, basiques et neutres conditionne le pHi d'une protéine. Le pHi est le pH pour lequel charges négatives et positives d’une protéine sont égales. Plus il est bas, plus la protéine contient une proportion élevée d’acides aminés portant une fonction acide supplémentaire et plus les charges électriques négatives de surface sont nombreuses, ce qui augmente l’affinité pour les cations. Le point isoélectrique (pHi) moyen calculé pour les 2 630 protéines de Halobacterium prédites par le séquençage est d’environ 4,9 avec un pic à 4,2 alors que le pHi moyen des protéomes d’organismes non halophiles est proche de 7 avec une distribution bimodale correspondant à deux sous ensembles de protéines : acides (pHi proche de 5) et basiques (pHi proche de 10). Cette caractéristique peut être aisément mise en évidence en comparant, avec les logiciels de la famille Rastop ou avec l’application Chime pour les navigateurs Internet, deux protéines homologues provenant, l’une, d’une bactérie halophile extrême, l’autre, d’une bactérie non halophile, par exemple une malate déshydrogénase de l’espèce Haloarcula marismortui, une halophile extrême proche de H. salinarum, et une enzyme homologue d’une espèce non halophile, la lactate déshydrogénase d’un lactobacille. Les informations sur ces molécules et leurs modèles moléculaires sont accessibles avec les identifiants respectifs 1d3a et 1EZ4 sur le site Internet de la banque européenne de données macromoléculaires à :
http://www.ebi.ac.uk/msd/
Si votre navigateur est équipé de l'application CHIME ou si vous disposez d'un logiciel d'infographie moléculaire, vous pouvez les ouvrir directement sur ce site :
Lactate déshydrogénase de lactobacille
Malate déshydrogénase de Haloarcula marismortui
On peut alors sélectionner les acides glutamique et aspartique et les figurer différemment des autres par la forme et la couleur. Diverses protéines, enzymes, facteurs de transcription ou autres que l'on peut trouver dans les banques de données peuvent être utilisées pour ce type d’activité si leur structure tridimensionnelle a été établie. Les figures ci-dessous montrent le résultat de ces traitements pour les deux protéines prises en exemple.



Lactate déshydrogénase de lactobacille Malate déshydrogénase de Haloarcula marismortui
Noter que les acides aminés acides (boules rouges) sont beaucoup plus abondants à la surface de la protéine halophile

Résistance à la dessiccation

Lorsque la saturation en sel intervient dans le milieu et que le sel cristallise, les cellules de Halobacterium emprisonnées dans les cristaux de sel restent vivantes. Ces cristaux peuvent être conservés longtemps et utilisés ultérieurement pour ensemencer un milieu de culture où l'on va voir alors se développer les bactéries, démontrant ainsi leur résistance extraordinaire à la dessiccation et au sel. Cette propriété peut être aisément mise en évidence expérimentalement.

Protocole
Réaliser une culture en milieu liquide et la laisser se développer pendant quelques jours jusqu'à ce que le milieu soit suffisamment trouble, correspondant à un grand nombre de cellules.
Abandonner quelques millilitres de la culture dans une boîte de Pétri jusqu'à ce que l’évaporation aboutisse à la cristallisation du sel. Celui-ci se colore en emprisonnant les cellules bactériennes, comme on le voit sur le cliché ci-dessous.

Cristaux de sel résultant de l'évaporation d'une culture de H. salinarum en milieu liquide

Ces cristaux peuvent être conservés très longtemps à l’abri de l’humidité et être utilisés pour ensemencer des milieux de culture et redonner naissance à des colonies bactériennes :

1. Les cristaux sont déposés directement à la surface du milieu et ils se dissolvent à son contact. Les boîtes sont ensuite emballées dans un sachet étanche et placées retournées, couvercle vers le bas.

2. Les cristaux sont dissous dans du milieu de culture liquide et une goutte du liquide est prélevée pour être étalée sur milieu solide. Les boîtes sont ensuite emballées dans un sachet étanche et placées retournées, couvercle vers le bas.

Résultats
Dans les deux cas, après une semaine de culture à 37°C ou deux semaines à température ambiante, on voit apparaître les colonies roses typiques de la bactérie, démontrant ainsi leur exceptionnelle capacité de résistance à la dessiccation et au sel.
Cristaux de sel résultant de l'évaporation d'une culture en milieu liquide de H. salinarum déposés à la surface d'un milieu solide Groupes de colonies issues des dépôts ci-contre
 Noter la coïncidence de l'emplacement des groupes de colonies avec celui des cristaux sur l'image précédente
Colonies obtenues à la suite de l'étalement d'une goutte de milieu liquide dans lequel a été dissous un cristal de sel contenant des bactéries

Certains chercheurs affirment avoir isolé des halophiles extrêmes de dépôts salins provenant de couches géologiques très anciennes. En outre, la résistance exceptionnelle de ces bactéries à la dessiccation, mais aussi aux rayonnements, en font des candidats potentiels à la colonisation de planètes extraterrestres par la vie car elles résistent à un voyage dans le vide spatial, comme l'ont montré des expériences menées par l'Agence spatiale européenne.

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Didier Pol © 2007 
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