Présentation et culture de l'archéobactérie halophile extrême Halobacterium salinarum

• Introduction

Halobacterium salinarum est une archéobactérie extrêmophile qui colonise des milieux aquatiques dont la concentration en chlorure de sodium est proche de la saturation et où la plupart des autres organismes ne peuvent survivre. Ce microorganisme présente un métabolisme énergétique comportant des modalités variées : respiration aérobie et anaérobie, phototrophie et fermentation. Associé, d'une part, à la capacité à détecter et discriminer différentes longueurs d'onde de la lumière, diverses substances organiques ou encore la concentration en dioxygène dissous et, d'autre part, à la propriété de se déplacer par rapport à ces stimulus à l'aide de flagelles, ce métabolisme flexible lui confère d’exceptionnelles capacités d’adaptation. H. salinarum présente en outre une extraordinaire résistance au sel et à la dessiccation ainsi qu'au rayonnement ultraviolet. Enfin, cette espèce présente un taux de mutations spontanées particulièrement élevé (de 10^-2 à 10^-5 selon les caractères, alors que le taux habituel est de 10^-6) qui permet d'obtenir des mutants en culture sans avoir à mettre en œuvre de système de mutagenèse provoquée.

Compte tenu de la facilité de sa culture et de sa manipulation au laboratoire, de l’absence de risque de contamination des milieux de culture par d’autres microorganismes (rien d'autre ne pousse à de telles concentrations en sel), de son innocuité pour l’homme et de la diversité des problèmes biologiques qu’il permet d’explorer, H. salinarum et les espèces proches constituent des microorganismes exceptionnels pour mener des activités scientifiques variées en classe, qu'il s'agisse de microbiologie, d'écologie, de métabolisme énergétique, de génétique, etc. Ajoutons que la connaissance approfondie de son génome, dont la séquence a été établie en 2000, apporte des informations précieuses dont l’accès est public. L'article correspondant (en anglais) peut être consulté librement à l'adresse :
http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/22/12176

• Culture sur milieu solide
• Comme aucun autre microorganisme n'est susceptible de contaminer le milieu en raison de sa concentration en sel, l'utilisation de H. salinarum rend possible l’apprentissage par les élèves des techniques de base de la microbiologie, en particulier la mise en culture de bactéries, l’isolement de colonies, le suivi de la croissance au colorimètre ou par étalement, etc. sans aucun risque de voir se développer d’autres bactéries ou de voir le milieu envahi par des microorganismes indésirables, même si les élèves ne respectent pas rigoureusement les conditions de travail en asepsie.  En réalité, les conditions de travail en asepsie ne sont même pas nécessaires, mais il est bon que les élèves apprennent à les respecter.

• Ne jamais mettre une colonie dans l’eau, ni même dans de l’eau physiologique : lorsque la concentration en sel est inférieure à 1,5 mol/L, les cellules de Halobacterium sont détruites. Chaque fois que l’on veut mettre une colonie en suspension, il convient d’utiliser, soit du milieu de culture liquide, soit du milieu minéral liquide.

1. Pour un simple isolement de colonies : étalement en stries classique.

Pour les détails techniques, voir :
Isolement de colonies de microorganismes sur milieu gélosé

Colonies isolées par étalement en stries
Noter les colonies colorées en rose et les traces dues à l'écoulement d'eau de condensation.

2. Pour repiquage ou obtention de nombreuses colonies : dilutions en série
 
Préparer une série de tubes à hémolyse avec 1 mL de milieu de culture liquide dans chaque.
Prélever une colonie avec une anse et la déposer dans le milieu contenu dans un des tubes en faisant tourner rapidement l’anse entre les doigts pour décrocher la colonie. Une colonie contient environ 100 millions de cellules. Fermer le tube et l’agiter vigoureusement à la main ou, mieux, sur vortex pour bien mettre en suspension les cellules qui ont tendance à rester collées entre elles.
Prélever 100 µL (3 gouttes) de cette suspension avec une pipette Pasteur et les déposer dans un autre tube contenant 1 mL de milieu de culture. Fermer le tube et l’agiter vigoureusement.
Recommencer les opérations pour obtenir au total six tubes : les dilutions croissantes permettront, théoriquement, d’obtenir une centaine de cellules dans 100 µL prélevés dans le tube 6 et donc une centaine de colonies bien séparées après étalement sur le milieu solide avec un râteau (étaleur) et incubation.
C’est notamment la procédure à suivre pour observer des mutations spontanées détectables par la couleur des colonies. Mais comme le nombre de bactéries prélevé n’est jamais sûr, faire un étalement dans trois boîtes différentes à partir d’un prélèvement dans les tubes 4, 5 et 6.
Pour obtenir un tapis de bactéries, procédure à suivre si l’on veut, par exemple, extraire l’ADN, prélever une goutte de suspension dans le tube 1 ou 2 avec une pipette Pasteur et déposer la goutte au centre d’une boîte de milieu de culture.
Étaler la goutte soigneusement sur toute la surface avec un râteau.

Quelques milliers de colonies formées à la suite de l'étalement avec un râteau

Dans tous les cas de culture sur milieu solide :
Mettre les boîtes dans un sachet étanche pour empêcher l’évaporation et les placer retournées (couvercle vers le bas) à l’étuve à 37°C.
À cette température, il faut environ 1 semaine pour obtenir les colonies (le temps de doublement est d’environ 6 heures et il faut environ 25 générations pour voir une colonie).
À température ambiante, il faut environ 2 semaines.
Pour obtenir une croissance plus rapide, on peut placer les cultures jusqu'à 42°C maximum.

• Culture en milieu liquide

Début de la culture : le milieu est transparent	Après une semaine : le milieu est opaque

Culture en milieu liquide
Noter la couleur de la culture due aux pigments caroténoïdes contenus dans la membrane des cellules.

Les pigments présents chez H. salinarum absorbent le rayonnement ultraviolet. Lorsqu'une culture est exposée à une source de lumière ultraviolette de longueur d'onde 365 nm, elle réémet par fluorescence une lumière de couleur turquoise comme on le voit sur le cliché ci-dessous.

Culture exposée à un tube à UV (longueur d'onde 365 nm)

Milieu solide

Milieu complet liquide et milieu minéral

Conditions de culture

• Approvisionnement

TOUS DROITS RÉSERVÉS Didier Pol © 2007  N'hésitez pas à faire connaître vos impressions, commentaires, suggestions etc.

dpol#noos.fr