Fiche
technique
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Préparer un poste de travail à proximité d’un bec
bunsen avec un flacon d’alcool recouvert d’un couvercle, un bain-marie
réglé à 35°C, des ciseaux fins, des pinces fines,
une seringue de 1 mL et une de 5 mL, stériles.
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Préparer les solutions suivantes :
1- 2,6 g de sorbitol dans 20 mL de tampon phosphate pH 5 (sorbitol
à 13 %).
2- 2,1 g de saccharose dans 10 mL d’eau distillée (saccharose
21 %).
3- Solution de pectinase et cellulase (0,1 g pour 100 mL de la solution
1).
4- Eau stérile.
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Stériliser les solutions, quelques tubes à hémolyse
et quelques carrés d’aluminium par exposition aux UV pendant 15
min. Recouvrir les flacons stérilisés avec les carrés
d’aluminium.
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Placer un tube stérile contenant 9,5 mL de la solution de sorbitol
stérile dans le bain-marie.
Se
placer près du bec bunsen pour la suite des opérations.
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Laver une feuille de laitue dans de l’eau de Javel à 10 % pendant
5 min et rincer 3 fois à l’eau stérile.
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Découper en conditions stériles la feuille en carrés
de 5 mm x 5 mm avec des ciseaux stérilisés (tremper la lame
dans l’alcool et passer à la flamme, laisser refroidir).
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Placer 15 à 20 fragments dans le tube de sorbitol et le mettre au
bain-marie pendant 5 min.
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Ajouter 1 mL de la solution enzymatique au tube et mélanger doucement
en retournant le tube plusieurs fois.
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Incuber pendant 30 min à 1 h en agitant de temps en temps.
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Vérifier au microscope l'avancement de la destruction de la paroi.
Préparation d'un milieu solide
Solution 1 : macro-éléments (g/L) |
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Nitrate d’ammonium |
1,65 g |
Chlorure de calcium |
0,44 g |
Sulfate de magnésium |
0,37 g |
Nitrate de potassium |
1,9 g |
Phosphate monopotassique |
0,17 g |
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Solution 2 : micro-éléments (g/L) |
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Sulfate de fer |
27,85 mg |
EDTA dissodique |
37,25 mg |
Sulfate de manganèse |
22,30 mg |
Sulfate de zinc |
8,6 mg |
Acide borique |
6,2 mg |
Iodure de potassium |
0,83 mg |
Molybdate de sodium |
0,25 mg |
Sulfate de cuivre |
0,025 mg |
Chlorure de cobalt |
0,025 mg |
Protoplast isolation enzyme solution
SIGMA
Référence : P 7578
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