Préparation et mise en culture de protoplastes

• Préparer un poste de travail à proximité d’un bec bunsen avec un flacon d’alcool recouvert d’un couvercle, un bain-marie réglé à 35°C, des ciseaux fins, des pinces fines, une seringue de 1 mL et une de 5 mL, stériles.
• Préparer les solutions suivantes :

1- 2,6 g de sorbitol dans 20 mL de tampon phosphate pH 5 (sorbitol à 13 %).
2- 2,1 g de saccharose dans 10 mL d’eau distillée (saccharose 21 %).
3- Solution de pectinase et cellulase (0,1 g pour 100 mL de la solution 1).
4- Eau stérile.

• Stériliser les solutions, quelques tubes à hémolyse et quelques carrés d’aluminium par exposition aux UV pendant 15 min. Recouvrir les flacons stérilisés avec les carrés d’aluminium.
• Placer un tube stérile contenant 9,5 mL de la solution de sorbitol stérile dans le bain-marie.

• Laver une feuille de laitue dans de l’eau de Javel à 10 % pendant 5 min et rincer 3 fois à l’eau stérile.
• Découper en conditions stériles la feuille en carrés de 5 mm x 5 mm avec des ciseaux stérilisés (tremper la lame dans l’alcool et passer à la flamme, laisser refroidir).
• Placer 15 à 20 fragments dans le tube de sorbitol et le mettre au bain-marie pendant 5 min.
• Ajouter 1 mL de la solution enzymatique au tube et mélanger doucement en retournant le tube plusieurs fois.
• Incuber pendant 30 min à 1 h en agitant de temps en temps.
• Vérifier au microscope l'avancement de la destruction de la paroi.

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Préparation d'un milieu solide

• Stériliser aux UV un entonnoir, un carré de gaze et un petit bécher pendant 10 min.
• Prélever stérilement 5 mL de chacune des deux solutions minérales complètes (macroéléments et oligoéléments selon Murashige et Skoog) dans une fiole jaugée de 100 mL et compléter à 100 mL avec de l’eau distillée.
• Y dissoudre 3 g de saccharose et 0,8 g d’agar et ajuster le pH à 5,8.
• Autoclaver la solution après avoir recouvert le flacon d’un capuchon d’aluminium.
• Laisser refroidir jusqu'à une quarantaine de degrés, bien agiter et couler dans des boîtes de Pétri stériles sur la moitié de leur hauteur. Refermer les boîtes.


Mise en culture sur milieu solide
 

• Après l’incubation, filtrer le tube contenant les fragments de laitue sur la gaze stérile.
• Rincer avec 10 mL de sorbitol.
• Répartir le filtrat dans des tubes de centrifugeuse stériles et centrifuger 5 min à 2000 rpm.
• Eliminer le surnageant en gardant le culot au fond du tube.
• Remettre le culot en suspension dans 0,1 mL de la solution de saccharose avec un vortex.
• Prélever une goutte avec une pipette Pasteur stérile et examiner au microscope pour contrôler la présence de protoplastes.
• Mettre le reste en culture dans les boîtes de Pétri en déposant des gouttes séparées à la surface du milieu. Sceller le bord des boîtes avec du parafilm.
• Etiqueter les boîtes.

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