Fiche technique
Cinétique de la peroxydase en fonction de la concentration en substrat
Les peroxydases sont des hémoprotéines qui catalysent l’oxydation de nombreux substrats par le peroxyde d’hydrogène (eau oxygénée) selon l’équation bilan suivante :

H2O2 + RH2 ----- Peroxydase  ---->  2 H2O + R

L’enzyme est spécifique du peroxyde d’hydrogène comme accepteur d’hydrogène mais tolère divers substrats RH2 comme donneur d’hydrogène, par exemple des dérivés phénoliques comme le méthoxyphénol (gaïacol). Incolore au départ, il prend rapidement une teinte brune qui absorbe la lumière dans le bleu ou le vert lorsqu’il est oxydé. Cette propriété rend possible l’étude de la cinétique enzymatique par spectrophotométrie.

Solutions

  • Méthoxypénol à 3,5 mmol/l (0,43 g.L-1)
  • Peroxyde d'hydrogène à 10 volumes (eau oxygénée du pharmacien) dilué au 1/250 (3,5 mmol.L-1)
  • Extrait enzymatique grossièrement purifié (par centrifugation et filtration) et dilué au 1/5 ou enzyme du commerce (0,1 mg/mL).
  • Tampon phosphate pH 6,2
Tampon phosphate pH 6,2
Préparer une solution d'hydrogénophosphate disodique à 9,46 g.L-1 de phosphate anhydre (ou 23,86 g.L-1 de phosphate cristallisé, 12 H2O) et une solution de dihydrogénophosphate monopotassique à 9,06 g.L-1. Mélanger 200 mL de phosphate disodique avec 800 mL de phosphate monopotassique pour obtenir un litre de tampon de pH 6,2.

Mise en oeuvre pratique
Le peroxyde dilué au 1/250 est utilisé comme solution stock à partir de laquelle seront faites les différentes dilutions permettant d'obtenir des concentrations moindres. Pour obtenir des concentrations décroissantes en peroxyde, des volumes décroissants de peroxyde sont placés à chaque fois dans la cuve et le volume global est maintenu constant avec du tampon selon le tableau ci-dessous.

Unités : pour simplifier les unités lors des acquisitions, on considérera la concentration initiale en peroxyde comme la concentration 100 (unités arbitraires).

 
 Concentration   mL de H2O2   mL d'eau   mL de gaïacol 
 mL d'enzyme
100
2
0
1
0,5
75
1,5
0,5
1 
0,5
50
1
1
1
0,5
25
0,5
1,5
1
0,5
10
0,2
1,8
1
0,5
5 
0,1
1,9
1 
0,5
0 
0
2
1
0,5
1 mL de peroxyde, 1 mL de tampon phosphate pH 6,2 et 1 mL de méthoxyphénol sont placés dans la cuve pour le réglage du zéro d'absorption.
Au temps To, l'acquisition est déclenchée immédiatement après l'injection de 0,5 mL d'enzyme dans la cuve à travers l'orifice ménagé dans le couvercle.
La même opération est répétée pour les diverses concentrations étudiées après un rinçage soigneux de la cuve.

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Didier Pol © 2006 
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