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Séparation
par électrophorèse sur bande d'acétate de
cellulose des protéines du blanc d'oeuf d'oiseau :
comparaison du profil électrophorétique de différentes espèces |
- Introduction
- Protocole
- Résultats : comparaison des profils électrophorétiques du blanc d'œuf de quelques oiseaux
- Solutions
- Fournisseur
On estime que, chez les vertébrés, le nombre des gènes est de l’ordre d’une trentaine de milliers. La combinatoire des gènes et de leurs allèles détermine l’identité biologique mais elle n’est pas directement accessible à l’observation. On peut cependant caractériser l’identité biologique des cellules et des organismes en identifiant des éléments du phénotype dont la présence est directement liée à l’expression du programme génétique, comme les protéines que l'on peut qualifier de phénotype moléculaire.
Séparer les protéines du blanc d'oeuf par électrophorèse permet de les identifier et de les quantifier, ce qui revient à établir un profil d'expression des gènes correspondants.
Le blanc d'oeuf des oiseaux comporte différentes protéines en commun permettant de souligner leur parenté phylogénétique.
La comparaison de ces protéines, et donc des gènes correspondants, chez des espèces différentes peut ainsi être utilisée pour évaluer la proximité évolutive de différentes espèces.
L'électrophorèse des protéines peut être réalisée sur bandes d'acétate de cellulose, comme indiqué ici, ou sur gel d'agarose, comme indiqué à la page "Séparation par électrophorèse sur gel d'agarose des protéines du blanc d'œuf d'oiseau" où on trouvera également la composition en protéines du blanc d'oeuf de poule qui sert de référence car c'est la mieux connue.
Les échantillons sont constitués de 5 µL de blanc d'œuf (poule, cane, oie, caille, etc.) dilués au 1/2 dans l'eau distillée. Les échantillons de protéines pures sont constitués de 1 mg de chaque protéine (lysozyme et ovalbumine de poule) dissous dans 1 mL d'eau.
Compte tenu du très faible volume des échantillons nécessaires, il est conseillé de congeler le reste du blanc d'oeuf dans des tubes de quelques mL pour pouvoir les utiliser d'une année sur l'autre en ne décongelant à chaque fois qu'un seul tube. Ceci permet d'enrichir au fil des années une collection d'espèces variées. Outre les oeufs de poule, on peut trouver sur les marchés des oeufs de caille, de cane, d'oie et même d'autruche.
| 1. Trempage Mettre à tremper les bandes d'acétate de cellulose dans le tampon d'électrophorèse (tampon tris-véronal) pendant 10 à 20 minutes et remplir les deux compartiments de la cuve avec un même volume de tampon d'électrophorèse.. |
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2. Essorage Essorer l'excès de tampon en plaçant les bandes entre deux feuilles de papier absorbant (essuie-tout). |
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| 3. Mise en place de la bande Placer la bande sur le portoir en veillant à disposer la face absorbante vers le haut. La bande doit être tendue et ses extrémités doivent dépasser suffisamment pour tremper dans le tampon une fois le support placé dans la cuve. Mettre en place le(s) support(s) dans la cuve. NB Le dispositif de fixation de la bande sur le support varie selon les fabricants. |
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Mise en place de la bande sur le support |
Bandes en place dans la cuve |
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| 5. Dépôt des échantillons Prélever un échantillon et le déposer sur la bande, déjà en place sur son support, au milieu de la bande (car le lysozyme migre vers la cathode à pH basique) en prenant garde que la bande soit bien horizontale et que l'échantillon ne coule pas. On peut prélever et déposer les échantillons soit avec une micropipette, soit avec un capillaire. Recommencer pour chaque échantillon en laissant un espace suffisant pour ne pas risquer la fusion des échantillons qui diffusent légèrement lors du dépôt. Utiliser un applicateur différent pour chaque échantillon ou sinon, bien nettoyer l'applicateur entre chaque dépôt. 6. Migration Fermer la cuve, la relier au générateur en respectant les polarités (borne - reliée à la borne de la cuve du côté des dépôts) et mettre sous tension (environ 1 h de migration à 150 V). 7. Coloration Après migration, placer les bandes dans la solution de rouge ponceau pendant 10 minutes. 8. Décoloration 10. Décolorer le fond dans des bains successifs d’acide acétique à 5 %. Agiter le cas échéant pour accélérer la décoloration. |
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Après coloration par le rouge Ponceau, on obtient le résultat
ci-dessous :
L'analyse densitométrique permet de quantifier
les différentes protéines, comme ici pour le blanc d'oeuf
de poule.
Les profils électrophorétiques sont tracés avec l'un des deux outils logiciels distribués librement sur le Web, Digispec et Mesurim.
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| Tampon tris-véronal
Tris (hydroxyméthyl) aminométhane : 7,2 g Acide diéthylbarbiturique : 1,82 g Diéthylbarbiturate de sodium : 10,2 g Eau distillée : 1 L |
Solution de coloration : rouge ponceau
Rouge ponceau : 2 g Acide trichloracétique : 30 g Eau distillée : 1 L Solution de décoloration Acide acétique à 5 % |
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Bandes d'acétate de cellulose, tampon, colorants : SORDALAB |
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Didier Pol © 2006 |
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