Électrophorèse de fragments de restriction d'ADN végétal


Protocole

Extraction de l'ADN

1- Prélever 1.5 g de cotylédons obtenus par germination de graine de moutarde blanche (Sinapis alba). A défaut, des graines de navet (Brassica napus) ou de cresson (Lepidium sp) peuvent être utilisées.

2- Broyer soigneusement dans 5 mL de tampon SDS à 65°C avec un peu de sable dans un mortier.

3- Verser le broyat dans un flacon de 100 mL et rincer le pilon et le mortier dans le flacon avec 5 mL de tampon SDS. Fermer le goulot avec du parafilm et incuber à 65°C pendant 30 à 60 min en agitant de temps en temps. L'extrait passera du vert au brun pendant l'extraction.

4- Centrifuger l'extrait à 2500 tours/min (1000 g avec un rotor de diamètre 15 cm) pendant 5 min.

5- Pipeter le surnageant dans un autre tube de centrifugeuse sans toucher au culot.

6- Précipiter l'ADN en ajoutant un volume identique d'éthanol glacé au surnageant. Mélanger soigneusement les deux fractions en retournant doucement le tube pendant la précipitation. Au bout de 10 min un précipité cotonneux d'ADN se formera.

7- Récupérer le précipité en centrifugeant pendant 5 min à 2500 tours/min.

8- Éliminer le surnageant et sécher le culot en retournant le tube pendant 2 min sur une serviette en papier.

9- Dissoudre l'échantillon d'ADN en ajoutant 2 mL de tampon TE et en agitant. La solution d'ADN peut être conservée indéfiniment à - 20 °C.

Action des enzymes de restriction

Les enzymes de restriction sont distribuées par Sigma accompagnées d'un tampon de réaction spécifique concentré 10 fois. Reconstituer le tampon par une dilution au 1/10. Préparer dans des microtubes de centrifugeuse des aliquots de chaque enzyme comportant 25 unités d'enzyme dans le tampon correspondant.

Hind III

1- Préparer trois tubes contenant 25 unités de l'enzyme de restriction Hind III. Ajouter au premier 15 µL de la solution d'ADN préparée précédemment, au second 2.5 µg dans 15 µL d'ADN de thymus de veau et au troisième 1 µg dans 15 µL d'ADN de phage lambda. Conserver d'autres échantillons d'ADN non traité comme contrôles.

2- Incuber à 37°C pendant 60 min.

EcoR I et Hind III

1- Préparer deux tubes contenant 25 unités de EcoR I, deux tubes contenant 25 unités de Hind III et un tube contenant 4 µg d'ADN de phage lambda dans 60 µL de tampon TE.

2- Mettre 15 µL d'ADN de lambda (1 µg) dans deux tubes de EcoR I et dans un tube de Hind III et conserver un autre aliquote de 15 µL comme contrôle. Incuber au bain-marie à 37°C. Après 10 min transférer le contenu d'un tube EcoR I contenant l'ADN dans le tube d'enzyme Hind III restant. Incuber pendant une heure.

Préparation des gels

1- Mélanger tampon TBE et agarose à raison de 1 g d'agarose pour 100 mL de tampon. Faire bouillir pour faire fondre l'agarose.

2- Laisser refroidir jusqu'à environ 60°C (seuil de la souffrance au contact du flacon). Placer les joints pour fermer le support de gel et positionner le peigne à 1 mm du fond. Couler le gel sur 2 à 3 mm d'épaisseur.

3- Laisser refroidir, enlever le peigne et les joints et placer le support avec le gel dans la cuve d'électrophorèse, puits du côté de la cathode (pôle noir). Recouvrir de tampon TBE (réutilisable plusieurs fois).

4- Ajouter 3 à 5 µL de colorant de charge à chaque échantillon d'ADN et charger très lentement chaque puits avec 18 à 20 µL d'échantillon en faisant bien attention de ne pas verser l'échantillon hors du puits. On peut éventuellement placer une bande noire sous les puits pour faciliter leur visualisation. Repérer l'ordre des échantillons.

NB On peut aussi charger les puits à sec et placer le gel dans la cuve que l'on remplira ensuite très délicatement de tampon.

5- Fermer le couvercle et brancher l'alimentation. Laisser migrer jusqu'à ce que la bande de bleu de bromophénol ait atteint l'extrémité du gel. Débrancher l'alimentation.

Coloration des gels

1- Placer le gel dans la solution de bleu de méthylène pendant une vingtaine de minutes.

2- Récupérer le colorant (réutilisable) et immerger le gel dans de l'eau à 40 - 50 °C jusqu'à ce que les bandes d'ADN deviennent visibles. Si la coloration paraît insuffisante, on peut renouveler l'opération.

3- Les bandes seront mieux visibles sur un transilluminateur (dépoli éclairant pour observer les négatifs). Un filtre jaune profond ou orange améliore l'image notamment pour la photographier.

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Didier Pol © 2006 
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