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QUELQUES MANIPULATIONS ASSISTÉES OU NON PAR ORDINATEUR SUR LES LEVURES

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Introduction

Les Levures, ces champignons unicellulaires extraordinairement polyvalents dont il existe plusieurs centaines d'espèces, sont un objet d'études pratiques d'un grand intérêt pour les classes de lycée : on a souvent l'occasion d'étudier divers aspects de leur biologie, en particulier en classes de première S et terminales scientifiques où différentes séances de TP peuvent leur être consacrées.

Citons, pêle-mêle, l'organisation cellulaire, le bourgeonnement, la respiration, les fermentations, les biotechnologies etc.

Dans l'industrie, le suivi biochimique des processus fermentaires est automatisé et informatisé. Il peut en être de même au lycée grâce à l'existence de capteurs variés susceptibles d'être reliés à une interface d'ordinateur. On peut alors suivre, en continu et en temps réel, les variations de pH, de température etc. Toutefois, si ce type de suivi est intéressant, il se prête mal aux manipulations individuelles par les élèves en raison de la durée qu'il nécessite.

En revanche, quelques manipulations simples centrées sur l'efficacité fermentaire des Levures vis à vis de différents substrats sont rendues possibles en Expérimentation Assistée par Ordinateur (Ex.A.O.) par l'existence d'un capteur capable de détecter les produits volatils de la fermentation.

Ce capteur peut également être utilisé pour faire des mesures "à la main" en remplaçant la chaîne d'Ex.A.O. par une alimentation et un voltmètre.

L'utilisation de "petits" matériels comme les lames jetables de numération cellulaire et les bandelettes réactives de détection du glucose permettra de préciser certains résultats et d'affiner les interprétations. L'usage, très pratique, des bandelettes de détection du glucose peut aussi permettre de quantifier assez précisément les résultats : à cet effet, il faut acquérir un lecteur de bandelettes réactives auprès d'une pharmacie, chez les distributeurs de matériel pédagogique ou directement auprès du fabricant (Boehringer-Mannheim France 2, avenue du Vercors -B.P.59- 38242 Meylan Cedex. Tel : 05 76 76 30 00 ou encore Laboratoires Miles -Division Ames- Tour Bayer 13, rue Jean Jaurès 92807 Puteaux Cedex. Tel : 01 49 06 57 57).

Cet article ne décrit pas une séance de TP prête à l'emploi, mais quelques idées directrices avec leur mise en oeuvre pratique que chacun pourra adapter aux séances de TP qu'il souhaite organiser sur les Levures et la fermentation alcoolique.

Précisons aussi que le même capteur peut être utilisé pour étudier d'autres fermentations comme la fermentation butyrique, par exemple, mais la fermentation alcoolique est d'une souplesse et d'un confort d'utilisation bien supérieurs aux autres.



1- PROTOCOLE EXPERIMENTAL

1-1 Solutions à préparer à l'avance

On utilise de la Levure de boulangerie, bien adaptée à l'étude de la fermentation alcoolique car ses capacités respiratoires sont limitées par rapport à ses capacités fermentaires. Les Levures sont mises en suspension dans un tampon phosphate de pH 6.2 à raison de 5 g pour 100 mL de tampon.

Tampon phosphate pH 6.2

Préparer une solution d'hydrogénophosphate disodique à 9.46 g/l de phosphate anhydre (ou 23.86 g/l de phosphate cristallisé, 12 H2O) et une solution de dihydrogénophosphate monopotassique à 9.06 g/l. Mélanger 200 mL de phosphate disodique avec 800 mL de phosphate monopotassique pour obtenir un litre de tampon de pH 6.2.

Il est préférable de laisser les Levures en agitation dans le tampon pendant au moins 20 minutes avant les manipulations afin qu'elles épuisent le dioxygène du milieu et que la respiration ne vienne pas interférer avec la fermentation. Il est encore plus efficace de faire barboter de l'azote gazeux. Ne pas craindre de faire "buller" le diazote directement dans la suspension de Levures et de balayer lentement tout le volume de la suspension.

Par ailleurs, des solutions de saccharose, glucose, galactose, maltose et lactose à 300 mmol.L-1 de tampon phosphate et un empois d'amidon à 5% sont préparés.

Pour chaque expérience, on utilisera 2 mL de chacune d'entre elles avec 4 mL de suspension de Levures ce qui donnera une concentration finale en sucres de 100 mmol.L-1 pour les oses et diosides. En revanche, la concentration finale en amidon ne peut pas être connue en raison de sa structure moléculaire.

Préparation de l'empois d'amidon

Mélanger cinq grammes d'amidon soluble dans 20 mL de tampon. Pendant ce temps, porter à ébullition 80 mL du même tampon (tampon phosphate pH 6.2). Arrêter le chauffage et verser goutte à goutte l'amidon dans la solution chaude agitée par un barreau magnétique. Laisser refroidir et ajuster à 100 mL.

D'autre part, à partir d'une solution stock de glucose à 450 mmol.L-1 (soit 8.1 g dans 100 mL), on réalisera par dilutions successives des solutions à 300, 225, 150, 75, 37.5, 15 et 3 pour étudier l'effet de la concentration en substrat.

2 mL de chacune de ces solutions seront mélangés avec 4 mL de la suspension de Levures ce qui amènera à des concentrations finales de 150, 100, 75, 50, 25, 12.5, 5 et 1 mmol.L-1 dans l'enceinte de mesure.

 1-2 Matériels

Les matériels diffèrent évidemment selon que l'on veut faire une saisie automatisée ou une saisie manuelle. Si on ne dispose pas de matériel informatique, les manipulations restent néanmoins possibles. Dans ce cas, il faut disposer d'un multimètre (contrôleur universel) commuté en voltmètre dans une gamme couvrant 0 à 5 volts et d'une alimentation délivrant une tension stable de 5 V. L'utilisation d'une pile de 4.5 V pour alimenter le capteur est possible mais pas recommandée car la consommation électrique du capteur est loin d'être négligeable et la pile s'épuise vite.

Concernant le multimètre, il est préférable d'utiliser un modèle à aiguille dont le temps de réponse est beaucoup plus rapide que celui des multimètres numériques.

Rappelons que les laboratoires de Physique des lycées disposent de multimètres et d'alimentations qu'ils peuvent confier au laboratoire de Biologie pour une séance de TP (voilà de l'interdisciplinarité !).

1-2-1 Le capteur

Au départ, il s'agit d'un composant électronique détecteur de gaz utilisé pour la prévention des incendies : en présence de faibles quantités de gaz (500 à 5000 ppm), sa résistance interne varie de 10 KW à 1 KW selon la nature des gaz ce qui donne une tension de sortie variant entre 0 et 4.5 V pour une alimentation sous 5 V.

La sensibilité du capteur à l'éthanol est très forte ce qui a conduit à l'utiliser dans la fabrication de certains éthylomètres.

Il est cependant sensible mais dans une faible mesure à d'autres produits de la fermentation tels que le dioxyde de carbone, le glycérol ou des acides organiques.

Pour cette raison, les mesures obtenues au cours des expériences représenteront la production globale des produits de la fermentation même si c'est l'éthanol qui représente la plus grande source de réactivité du capteur.

Le capteur est disponible chez MICRELEC ou peut être facilement réalisé si l'on sait se servir d'un fer à souder (me consulter directement pour les références et les détails de construction).

1-2-2 Enceinte de mesure

L'enceinte de mesure peut être un flacon de 10 mL dont le goulot s'adapte au capteur. Dans les expériences présentées ici, l'enceinte est constituée d'un simple tube en plastique pour prélèvement urinaire dont le bouchon a été percé pour recevoir le capteur. Notons toutefois que la réponse du capteur est d'autant plus sensible que le volume de l'enceinte de mesure est légèrement supérieur au volume du milieu réactionnel.

Si l'on veut faire une étude véritablement quantitative, il faudra faire un étalonnage dans le flacon de mesure avec des volumes de liquides identiques à ceux utilisés dans les expériences et à la même température. De plus, il faudra tenir compte des sous-produits de la fermentation qui sont nombreux et volatils et qui donc participent en plus des vapeurs d'éthanol à la réponse du capteur (glycérol, éthanal, éthanoate).

Ils représentent environ 10 % de la masse d'éthanol produit.

Enfin, si on veut raccourcir la durée des mesures pour mieux l'adapter à celle de séances de TP il est préférable de faire toutes les mesures avec une enceinte placée dans un bain-marie thermostaté à 35°C afin d'augmenter les vitesses de réaction. Un barreau aimanté sera mis dans l'enceinte de culture et le bain-marie sera posé sur un agitateur magnétique. On peut aussi utiliser, plus simplement, un bécher rempli d'eau posé sur un agitateur magnétique chauffant, l'enceinte de culture étant à demi immergée dans l'eau du Bécher.

Les expériences dont les résultats sont donnés ici ont été conduites dans un bain-marie à 39°C, sans agitation. Toutefois, avec les élèves, il est plus prudent d'opérer à 35°C, valeur moins proche de la température d'inactivation des enzymes.

 1-2-3 Système d'acquisition de données

Dans ces expériences, j'ai utilisé l'interface d'acquisition de données "ORPHY GTS " de MICRELEC qui possède des entrées entre 0 et 5 volts. La gestion du système est assurée par le logiciel "REGRESSI" du même constructeur, logiciel généraliste qui affiche les mesures en temps réel sous forme d'un écran d'oscilloscope à mémoire et qui permet à l'utilisateur de définir tous les paramètres d'acquisition et de réaliser différents traitements sur les mesures de façon aisée.

Les mêmes manipulations peuvent, évidemment, être réalisées avec n'importe quel système d'acquisition pourvu qu'il dispose d'une entrée 0-5 V et d'un logiciel "généraliste".

1-2-4 Autres matériels

Des lames à numération jetables "KOVA" et des bandelettes réactives pour le glucose "GLUCOSTIX" (ou toute autre marque) dont l'usage est, bien entendu, indépendant de la saisie informatisée des mesures, permettent d'enrichir notablement l'interprétation des résultats graphiques des expériences.

1-3 Déroulement des manipulations

Dispositif expérimental


Schéma du montage

Au début de chaque expérience, on place dans le flacon de culture un volume de Levures adapté au flacon utilisé. Dans notre cas, 4 mL. On laisse la température de la suspension de Levures s'équilibrer pendant une dizaine de minutes. Si on utilise un système d'agitation, il faudra veiller à ce que la vitesse de l'agitation ne varie pas pendant les mesures car les variations de vitesse provoquent des artefacts sur les cinétiques.

Lorsque la tension du capteur reste stable (elle augmente légèrement lorsque les Levures sont mises en place) on déclenche l'acquisition et on injecte 2 mL de solution de substrat, maintenu préalablement au bain-marie, avec une seringue dont on aura enfoncé l'aiguille dans le bouchon de l'enceinte de culture.

Après un bref temps de latence (moins d'une minute), le capteur détecte la présence de gaz (éthanol essentiellement) et transmet à l'interface ou au voltmètre une tension proportionnelle à leur concentration dans l'air de l'enceinte que l'ordinateur traduit graphiquement sous forme d'une courbe (C) = f (t).
 

Si on utilise un voltmètre, les élèves font les relevés de la tension lue à intervalles de temps réguliers et l'inscrivent dans un tableau de mesure de façon à construire ultérieurement la courbe.

En outre, au début des manipulations, une numération des Levures est réalisée sur lames jetables "KOVA" à grille. A la fin, le milieu est conservé de façon à refaire cette numération les jours suivants ce qui permet de construire la courbe de croissance de la population de Levures en fonction des différents substrats.

Enfin, l'utilisation de bandelettes réactives pour le glucose permet de contrôler l'éventuelle présence de glucose dans les solutions des différents substrats avant l'expérience ainsi qu'après.



2- RESULTATS ET INTERPRETATION

2-1 Résultats

Les mesures ont été faites en utilisant les substrats suivants : glucose, saccharose, maltose, lactose, galactose, amidon. De plus, huit mesures de l'activité de fermentation de 4 mL de la suspension de Levures ont été effectuées en présence de 2 mL de solution de glucose de concentrations respectives : 450, 300, 225, 150, 75, 37.5, 15 et 3 mmol.L-1 correspondant à des concentrations finales dans l'enceinte de : 150, 100, 75, 50, 25, 12.5, 5 et 1.

La figure 1 montre la juxtaposition de cinq des cinétiques obtenues, les concentrations finales 25, 50 et 75 mmol.L-1 n'ayant pas été représentées pour que les différentes courbes restent bien individualisées sur le graphique.

Figure 1

Néanmoins, les cinétiques correspondant à ces valeurs ont été utilisées pour étudier l'effet de la concentration en substrat sur la vitesse initiale de la fermentation.

Le glucose est métabolisé rapidement par les Levures et transformé principalement en dioxyde de carbone et éthanol détecté par le capteur.

Plus la concentration en substrat est importante, et plus la fermentation est forte ce qui indique que le facteur limitant n'est pas la quantité de Levures, mais la quantité de substrat. Au delà d'une concentration finale de 100 mmol.L-1 , les résultats ne changent pratiquement pas dans l'intervalle de temps utilisé (lorsque la concentration finale passe de 100 à 150 mmol.L-1, la réponse du capteur n'augmente que de 1.9%, valeur à la limite des capacités de résolution du capteur).

Ceci semble indiquer que pour une concentration finale en substrat comprise entre 100 et 150 mmol.L-1, la quantité de Levures est devenue le facteur limitant. La comparaison des vitesses initiales pour ces deux concentrations confirme ce point de vue.



Avec le saccharose, une seule concentration de 100 mmol.L-1 a été testée. En effet, comme le montre la figure 3, l'efficacité fermentaire de la Levure pour le saccharose est pratiquement équivalente à celle du glucose (1 : glucose ; 2 : saccharose ; 3 : maltose).
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Figure 3

De plus, un test préalable avec une bandelette réactive pour le glucose s'est avéré négatif montrant que la solution initiale de saccharose était dépourvue de glucose : c'est bien le saccharose qui est fermenté intensément.

Le même contrôle réalisé après la fermentation avec du saccharose montre une concentration importante de glucose dans le milieu.



Le galactose, le lactose et l'amidon ne sont pas fermentés de façon significative comme le montre la juxtaposition sur le même graphe du résultat obtenu avec du glucose à 100 mmol.L-1 pour des concentrations finales équivalentes de ces sucres

(figure 4). 1 : glucose ; 2 : galactose ; 3 : lactose ; 4 : amidon

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Figure 4

Pour le galactose, la faible augmentation de la courbe a pu être expliquée : en effet, un test préalable de la solution de galactose avec une bandelette réactive a montré la présence d'une faible quantité de glucose dans cette solution.

En revanche, la très faible augmentation en présence de lactose ne peut s'expliquer par la même raison, le même test n'ayant pu permettre de détecter la moindre trace de glucose dans la solution de lactose. De toute façon, les variations observées en présence de ce sucre sont négligeables (moins de 1%) et ne peuvent pas être considérées comme significatives.

Le maltose donne des résultats intermédiaires comme le montre la figure 3 sur laquelle ont été juxtaposées les cinétiques correspondant à du glucose et à du saccharose à 100 mmol.L-1 l avec celle correspondant au maltose à la même concentration. La Levure a donc la capacité de fermenter le maltose, mais cette capacité est inférieure à celle enregistrée en présence de glucose et de saccharose.

Ainsi, les cinétiques concrétisent les données connues sur la Levure de bière : forte capacité à fermenter glucose et saccharose, capacité moindre à fermenter le maltose, incapacité à fermenter l'amidon, le lactose et le galactose*.



2-2 Interprétation

2-2-1 Cas du saccharose et du glucose

Le glucose pouvant pénétrer facilement à travers la paroi et la membrane cellulaire des Levures, il n'est pas étonnant qu'il soit fermenté. En revanche, les diosides ne pénètrent dans la cellule que si la membrane est pourvue d'une perméase spécifique. Il est donc légitime de se demander par quelle voie le saccharose est métabolisé.

La présence de glucose dans le milieu en fin de réaction, détecté par bandelette réactive, montre que le saccharose est hydrolysé par les Levures dans le milieu extracellulaire : en effet, l'invertase fait partie de l'équipement enzymatique des Levures. On peut donc supposer qu'elle est sécrétée dans le milieu. Ce point peut être vérifié en utilisant du milieu de culture dilué au dixième et filtré pour éliminer toutes les cellules de Levures : après mesure de la concentration en glucose avec une bandelette réactive, on incube 5 mL de filtrat une vingtaine de minutes avec 5 mL de la solution de saccharose au bain-marie. Une nouvelle mesure avec une bandelette réactive montre une importante augmentation de la concentration en glucose démontrant ainsi que les Levures sont capables de sécréter une invertase dans le milieu.

Du glucose et du fructose sont donc absorbés et fermentés par les Levures après hydrolyse enzymatique extra-cellulaire du saccharose par une invertase exportable.

2-2-2 Amidon, lactose et galactose

En ce qui concerne l'amidon, sa structure moléculaire rend sa pénétration impossible à l'intérieur des cellules. L'amidon ne peut être métabolisé directement par la Levure qui ne possède pas d'amylase exportable, ce qui explique que l'on soit obligé d'utiliser des moûts à base de malt végétal en brasserie lorsque l'on veut obtenir la fermentation de substances amylacées.

En ce qui concerne le galactose, la taille de la molécule n'empêche pas son entrée dans les cellules, mais ces dernières ne possèdent pas l'équipement enzymatique nécessaire pour le convertir en sucre métabolisable*.

Le lactose n'est pas métabolisé. Ou bien il ne pénètre pas dans les cellules, la pénétration de disaccharides nécessitant la présence de perméases spécifiques, ou bien, ces perméases existent mais la Levure ne possède pas de lactase. Cette dernière est d'ailleurs extrêmement rare chez les Levures, même chez les espèces capables de fermenter le galactose.

2-2-3 Cas du maltose

Le maltose est fermenté de manière non négligeable quoique beaucoup moins fortement que le glucose ou le saccharose. En outre, l'utilisation de bandelettes réactives montre qu'il y a très peu de glucose dans le milieu de culture à la fin de l'expérience contrairement à ce qui a été observé précédemment avec le saccharose : aussi, on peut supposer que la Levure possède une perméase pour le maltose. Il serait donc hydrolysé à l'intérieur des cellules qui ne seraient pas capables de sécréter leur maltase contrairement à leur invertase.


2-3 Numération des Levures

Il est également intéressant de réaliser la numération des Levures pour apprécier leurs capacités de croissance sur différents milieux. Les lames jetables à numération "KOVA" à grille permettent de le faire de façon simple et peu coûteuse.

Ces lames sont pourvues de dix chambres de 6 µL comportant une grille, visible au microscope, correspondant à un volume de 1 µL. Il y a neuf cases par grille, chaque case étant subdivisée en neuf carrés plus petits. Chaque lame permet de faire dix numérations.

Au début des manipulations, on prélève un échantillon de Levures en agitation et on le dilue au 1/50 (0.1 mL dans 4.9 mL d'eau) si on utilise une suspension de Levures à 5 %. Avec une pipette Pasteur, on introduit une goutte dans une chambre qui se remplit entièrement par capillarité. Au grossissement moyen du microscope (x 100), on compte les cellules présentes dans un ou plusieurs petits carrés (dans ce dernier cas, on fait la moyenne). Avec une suspension préparée une heure avant et agitée, j'ai obtenu des valeurs dont la moyenne est n = 126. La notice de ces lames explique pourquoi le nombre de cellules par µL est égal à n x 90 soit ici, 11340. La méthode est fiable car dans les nombreuses fermentations réalisées avec la même concentration de Levures, les valeurs obtenues varient entre 10000 et 15000 cellules par µl.

Compte tenu de la dilution, il faut multiplier le résultat par 50 soit 567000 cellules par µL.

C'est une bonne occasion de familiariser les élèves avec les problèmes de comptage des cellules et de dilutions ainsi qu'avec les petits calculs qui leur sont liés et il me semble important que les élèves se familiarisent avec les ordres de grandeur de l'échelle cellulaire.

En effet, dans notre flacon contenant 4 mL de Levures, il y a en réalité 2.3 x 109 cellules !

Si l'on refait une numération à intervalles réguliers (sans oublier d'agiter le milieu à chaque prélèvement), on pourra constater l'accroissement de population en fonction du temps pour des substrats différents : au bout de 24 h avec le glucose, le nombre de cellules a été multiplié par 1.2. Il est intéressant de comparer avec un milieu placé en aérobiose (mais dans ce cas, il faudra utiliser une concentration en glucose beaucoup plus faible, 0.01 % soit 5.5 µmol.L-1 à renouveler régulièrement).


2-4 Pour aller plus loin...

Le traitement informatique des mesures peut permettre de pousser un peu plus loin l'analyse. Ainsi, en utilisant les valeurs expérimentales obtenues lors de fermentations avec des concentrations croissantes de glucose, il est possible de calculer la vitesse initiale de la fermentation dans chacun des cas afin de construire la courbe classique Vi = f [substrat].

Pour compléter les données, huit concentrations différentes en glucose ont été testées (de 1 à 150 mmol.L-1 de concentration finale).

La figure 5 montre les résultats obtenus lorsque l'on reporte la vitesse initiale de la réaction, mesurée par le coefficient directeur de la tangente à la partie initiale de la cinétique, en fonction de la concentration en glucose.

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Figure 5

L'aspect de la cinétique évoque une cinétique Michaëlienne typique dont il serait possible de déduire, avec des élèves d'un niveau supérieur à celui du lycée (DEUG, CPGE), les paramètres classiques de cinétique enzymatique, Vmax et Km. Les calculs et les différentes représentations graphiques n'ont pas été faits ici car ils outrepassent les programmes de second cycle**.


Conclusion

Ces quelques manipulations simples à réaliser permettent donc d'établir une sorte de répertoire enzymatique de la levure de boulangerie à partir de l'analyse des résultats expérimentaux mais peuvent aussi servir de point de départ à une réflexion sur l'utilisation des Levures dans les biotechnologies.

Ces activités peuvent donc s'intégrer en 1°S dans le cadre de l'étude des enzymes ou des fermentations ou encore en terminales scientifiques dans le cadre du métabolisme énergétique ou pour faire saisir de façon pratique les notions d'enzymes exportables ou non.

De plus, l'étude de la croissance de la population est l'occasion de manipuler un matériel original, de faire quelques calculs simples de dilution et de réaliser les ordres de grandeur impliqués, exercices formateurs dans toutes les classes des lycées où peuvent se pratiquer ces manipulations.

Enfin, si le Professeur a le temps de faire les traitements adéquats, il pourra présenter à ses élèves la cinétique correspondant à la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat (figure 4), indispensable à la compréhension de la notion de complexe enzyme-substrat. 

NB : "Orphy GTS " est une marque déposée de MICRELEC, "Glucostix " est une marque déposée des laboratoires MILES, "Kova " est une marque déposée de BOEHRINGER-MANNHEIM.

Notes ajoutées à la relecture de l'article cinq ans plus tard...

* En fait, le métabolisme du galactose est réprimé mais il peut parfaitement fonctionner après une phase d'induction.
** On trouvera la modélisation de l'équation de Michaelis à la figure 6.

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Figure 6


Bibliographie

Bernhard S.A. Structure et Fonction des Enzymes. Edition française dirigée par Mme F. Labeyrie. Ediscience, 1969
Haldane J.B.S. Enzymes. Longmans Green and C°, London, 1930. Réimpression : Cambridge, Massachusetts, the M.I.T. Press, 1965
Ribéreau-Gayon J. Sciences et Techniques du Vin. Traité d'œnologie. Tome 2. Dunod, 1975
2ème Symposium International d'œnologie
. Fermentations et Vinifications. I.N.R.A., 1968


Pour plus de renseignements sur les travaux pratiques utilisant des levures, voir : Travaux pratiques de biologie des levures, Ellipses, 1996.

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