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 A PROPOS D’ENZYMES ET DE LEUR UTILISATION PEDAGOGIQUE 
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Introduction

C'est en 1830 que fut mise en évidence pour la première fois l'action d'une enzyme et elle fut isolée deux ans plus tard sous le nom de diastase car elle séparait les dextrines et le maltose de l'amidon (du grec diastasis, séparation). En 1835, Berzélius eut l'intuition que ce type de réaction, due à ce qu'il appelait une "force catalytique", était beaucoup plus répandu qu'on ne le croyait alors. Le terme d'enzyme fut forgé par W. Kühne en 1878 à partir des termes grecs, zumé (levain) et en (dedans), pour remplacer ceux de ferment et de diastase jugés trop restrictifs. Dés le début de ce siècle, les travaux de Willstaetter, de Sumner et de Northrop conduisirent aux premières cristallisations d'enzymes après que leur nature protéique eut été démontrée.

L'élucidation des différentes voies du métabolisme cellulaire put être réalisée quand on eut compris que chaque réaction était liée à une enzyme déterminée et pouvait être étudiée in vitro si l'enzyme correspondante était isolée.

Enfin, l'aphorisme de Beadle et Tatum "un gène, une enzyme" est devenu à juste titre célèbre parmi les biologistes et rappelle le rôle central de ces substances dans l'expression du génotype en phénotype même si l'on sait maintenant que tous les gènes ne codent pas nécessairement une enzyme.

Actuellement, plusieurs milliers d'enzymes sont connues, la séquence des acides aminés de près de trois mille d'entre elles a été élucidée et les gènes qui déterminent leur synthèse localisés et séquencés. Nombre d'entre elles sont utilisées industriellement (biotechnologies, lessives, jus de fruits, production de sucre à partir d'amidon, traitement des peaux, des fibres textiles etc.) et d'autres sont de merveilleux outils dans la recherche biomédicale. On commence également à fabriquer des enzymes artificielles plus stables dans des environnements physico-chimiques extrêmes.

Il s'agit donc d'un thème à la fois très intéressant historiquement et pour sa valeur heuristique, très prometteur au point de vue économique, essentiel pour la compréhension du fonctionnement des êtres vivants et indispensable à la culture scientifique de nos élèves.

Dans les programmes des lycées, l'étude des enzymes en tant que telles fait partie intégrante du nouveau programme de première S sous le titre "Les enzymes, agents de catalyse" dans le chapitre "Edification de l'organisme, maintien de son identité biologique et information génétique". Cette formulation est moins restrictive que celle qui, dans le passé, incluait l'étude des enzymes dans le cadre étroit de la simplification moléculaire au cours de la digestion.

De plus, l'étude de certaines activités enzymatiques peut s'avérer une aide précieuse pour compléter l'étude de divers points du programme dans toutes les classes : les trois exemples proposés ici permettront grâce à des manipulations de TP, en général assez simples, d'illustrer ou d'approfondir des thèmes qui, à priori, sont fort éloignés de l'étude des enzymes.

Les enzymes dont il est question dans cet article peuvent être aisément préparées au lycée par le professeur, un technicien de laboratoire ou les élèves.

Leur présentation suit un même plan : préparation, mise en évidence de l'activité, applications pédagogiques.

J'ai indiqué la nomenclature officielle de chaque enzyme qui devrait tendre à remplacer les noms traditionnels, mais pas son numéro dans la nomenclature internationale qui n'a guère d'intérêt pour les élèves des lycées.

I- PEROXYDASE DU RAIFORT
  (Donneur d'hydrogène-peroxyde oxydo-réductase)

C'est probablement l'enzyme qui présente le meilleur rapport entre la facilité de préparation et de conservation et la variété des applications pédagogiques possibles.

I-1 Préparation, conservation et purification

On peut préparer la peroxydase soit à partir d'un morceau de racine de Raifort (Radis noir) soit à partir d'un Radis.

Couper un morceau de Raifort ou de Radis en petits morceaux après l'avoir épluché. Placer les morceaux dans un mixer avec de l'eau distillée et broyer. Filtrer. On obtient un extrait brut extrêmement efficace qui peut être dilué avant utilisation.

Il est possible de réaliser une extraction plus soignée en vue d'une purification éventuelle. Dans ce cas, placer le pot du mixer au congélateur ainsi que l'eau distillée, un entonnoir, un erlenmeyer, un flacon d'acétone et le morceau de Raifort épluché. Préparer de la glace pilée dans un cristallisoir.

Après 15 mn au congélateur, sortir le Raifort et le couper en petits morceaux. Placer le pot du mixer dans la glace pilée et broyer les morceaux avec de l'eau distillée glacée (100 mL pour un morceau de Radis noir de 5 cm de côté). Filtrer, si possible sur filtre de Büchner, et recueillir le filtrat dans l'erlenmeyer sorti du congélateur et disposé dans la glace pilée. Centrifuger.

Verser de l'acétone sortie du congélateur dans le filtrat, volume à volume et laisser à température ambiante pendant quelques heures : il se forme un précipité.

Filtrer pour éliminer l'acétone et conserver le résidu sur le filtre. Déployer le filtre portant le précipité dans un cristallisoir et bien le laver avec de l'eau distillée : la solution obtenue est de la peroxydase partiellement purifiée.

Répartir la solution en aliquotes dans des tubes à hémolyse et les placer au congélateur. Le contenu d'un tube dilué après décongélation suffit pour une séance de TP de toute une classe.

Il n'est pas obligatoire de réaliser toutes ces étapes, mais lorsqu'on procède à des études colorimétriques, il est préférable d'avoir des extraits limpides. Toutefois, l'extrait brut marche très bien et se conserve aussi très bien au congélateur. Si on veut l'utiliser pour la colorimétrie, il sera préférable de le filtrer ou de le centrifuger après décongélation.

I-2 Mise en évidence de l'activité enzymatique

Les peroxydases (il existe un grand nombre d'isoenzymes) sont des oxydo-réductases qui catalysent la décomposition du peroxyde d'hydrogène ("eau oxygénée") en eau selon la réaction :  

         Peroxydase
    H2O2 + RH2 --------------> 2 H2O + R
L'enzyme est spécifique du peroxyde d'hydrogène comme accepteur d'hydrogène mais tolère de très nombreux substrats RH2 comme donneur d'hydrogène. Ces substrats sont des dérivés phénoliques comme le méthoxyphénol ("gaïacol"), la dianisidine, la diaminobenzidine (attention, cancérogène), le 4-hydroxydiphényl et la 1,2-phénylènediamine (les deux donneurs les plus actifs) etc. Ils changent de couleur lorsqu'ils sont oxydés par l'enzyme. Cette propriété rend possible l'étude de l'activité enzymatique par photocolorimétrie.
I-3 Applications pédagogiques

I-3-1 Etude expérimentale de la catalyse enzymatique (ExAO)

(Les enzymes, agents de catalyse, première S)

Le grand avantage de la peroxydase est la vitesse de la réaction (moins d'une minute pour des concentrations élevées) qui rend possible la réalisation de plusieurs réactions par chaque élève au cours d'une séance de TP. L'enzyme se prête ainsi facilement à une étude de l'effet de la concentration en substrat ou en enzyme sur la vitesse initiale. Notons toutefois que les Km pour le peroxyde et pour le donneur d'hydrogène sont interdépendants et qu'il faudra donc travailler à concentration constante en donneur d'hydrogène.

Le système peroxydase-peroxyde d'hydrogène-méthoxyphénol est bien adapté à une étude colorimétrique car, incolore au départ, il prend rapidement une teinte brune qui absorbe bien la lumière dans le bleu ou le vert.

Les résultats présentés ici ont été obtenus avec le module Photocolor, le logiciel généraliste Régressi et l'interface Orphy-GTS de MICRELEC.

Il va de soi que n'importe quelle chaîne d'ExAO comportant un photocolorimètre est utilisable.

Solutions
Méthoxypénol à 3.5 mmol/l (0.43 g.L-1), peroxyde d'hydrogène à 10 volumes (eau oxygénée du pharmacien) dilué au 1/250 (3.5 mmol.L-1), extrait enzymatique grossièrement purifié (par centrifugation et filtration) et dilué au 1/5.

Tampon phosphate pH 6.2
Préparer une solution d'hydrogénophosphate disodique à 9.46 g.L-1 de phosphate anhydre (ou 23.86 g.L-1 de phosphate cristallisé, 12 H2O) et une solution de dihydrogénophosphate monopotassique à 9.06 g.L-1. Mélanger 200 mL de phosphate disodique avec 800 mL de phosphate monopotassique pour obtenir un litre de tampon de pH 6.2.

Mise en oeuvre pratique
Le peroxyde dilué au 1/250 est utilisé comme solution stock à partir de laquelle seront faites les différentes dilutions permettant d'obtenir des concentrations moindres. 1 mL de peroxyde, 1 mL de tampon phosphate pH 6.2 et 1 mL de méthoxyphénol sont placés dans la cuve pour le réglage du zéro d'absorption. Au temps To, l'acquisition est déclenchée immédiatement après l'injection de 0.5 mL d'enzyme dans la cuve à travers l'orifice ménagé dans le couvercle. La même opération est répétée pour les diverses concentrations étudiées après un rinçage soigneux de la cuve. Pour obtenir des concentrations décroissantes en peroxyde, des volumes moindres sont placés à chaque fois dans la cuve et le volume global est maintenu constant avec du tampon.

La figure 1 présente la superposition de six cinétiques pour des concentrations croissantes en substrat.

Les résultats de huit mesures ont ensuite été traités par le logiciel pour déterminer la vitesse initiale de la réaction pour chaque concentration en substrat (coefficient directeur de la partie linéaire initiale de chaque courbe). La vitesse initiale calculée pour chaque expérience a ensuite été reportée en fonction de la concentration en substrat.

Le résultat est présenté à la figure 2.

Il s'agit d'une cinétique d'allure typiquement michaëlienne avec sa vitesse croissant linéairement aux faibles concentrations et son plateau montrant la saturation de l'enzyme par le substrat aux fortes concentrations. On peut alors déterminer graphiquement la vitesse maximale de la réaction dans ces conditions ainsi que le Km (concentration correspondant à la moitié de la vitesse maximale).

Dans une autre expérience, on a fait varier la concentration en enzyme dans le milieu réactionnel par des dilutions croissantes de l'extrait enzymatique tout en conservant une concentration en substrat largement supérieure à celle de l'enzyme. Dans ces conditions, toute augmentation de la concentration en enzyme s'accompagne d'une augmentation proportionnelle de la vitesse initiale de réaction comme le montre la figure 3 représentant la vitesse initiale en fonction de la concentration en enzyme (exprimée ici par la dilution de l'extrait).

L'analyse des figures 2 et 3 permet de comprendre qu'au cours de la réaction enzymatique se forme un complexe enzyme-substrat qui représente le facteur limitant de l'activité enzymatique.

I-3-2 Autres possibilités applicables en première S

En dehors de ce problème essentiel du complexe enzyme-substrat, il est, bien entendu, très facile de réaliser les expériences classiques pour montrer l'influence de la température ou du pH sur la cinétique enzymatique. On peut mener les études classiques relatives à l'activité enzymatique dans différentes conditions :

- pH

Le pH optimum de l'enzyme est entre 6.0 et 6.5. En utilisant des tampons de différents pH, on mesurera le temps nécessaire pour obtenir la coloration maximale, y compris sans colorimètre, et tracer la courbe de la vitesse (= activité) en fonction du pH. Ainsi, à pH 7.5, l'activité de l'enzyme n'est plus que de 84 % du maximum.

- Température

On peut réaliser le même type de manipulation en utilisant diverses températures. La peroxydase est assez stable et conserve son activité pendant au moins 10 mn à 60°C.

- Inhibiteurs de l'enzyme

Plusieurs substances inhibent la peroxydase : les cyanures (à des concentrations de l'ordre de 10 µmol.L-1), sulfures (1 µ mol.L-1), fluorures (1 mmol.L-1).

I-3-3 Comment les chercheurs tracent-ils les voies nerveuses ?

(Supports cytologiques des messages nerveux TS)

Lorsqu'on injecte une solution de peroxydase dans une région du système nerveux, on a remarqué que l'enzyme était captée par les terminaisons axonales présentes dans cette zone, vraisemblablement par endocytose sans que cela soit prouvé, puis entraînée par le transport rétrograde vers le corps cellulaire. Si on traite alors des coupes de tissu nerveux par un système révélateur de l'enzyme, on retrouvera le marquage dans les péricaryons qui émettent des axones vers le point d'injection. On a ainsi pu dresser la carte des connexions entre de nombreuses structures cérébrales (voies visuelles et auditives par exemple). Comme il n'est pas question d'injecter puis de sacrifier un animal au lycée, on travaillera sur un modèle.

Le modèle consiste en un neurone fait de papier filtre selon le schéma de la figure suivante.

Mise en oeuvre pratique

Une goutte de solution d'enzyme est déposée avec une pipette Pasteur sur la terminaison de l'"axone" au niveau marqué d'un point sur le schéma. Le "neurone" est alors placé dans un tube à essai contenant de l'alcool à 70 % sur une hauteur de 1 cm de façon à ce que le dépôt ne soit pas immergé. Le tube est bouché et 45 mn plus tard, le "neurone" est enlevé du tube, trempé dans un bain de méthoxyphénol à 1 g.L-1 puis dans un bain de peroxyde d'hydrogène à 10 volumes dilué au 1/10. Le "corps cellulaire" se colore en brun.

S'agissant d'un modèle grossier, il convient de préciser aux élèves que les mécanismes et les durées sont différents : le transport rétrograde se fait à une vitesse de 200 à 250 mm/jour et son mécanisme n'est pas connu en détail.

Ce transport, outre son intérêt méthodologique pour le traçage des voies nerveuses (beaucoup plus simple que la technique de dégénérescence Wallerienne), est très important pour le neurone car il amène vers le corps cellulaire des substances essentielles comme le facteur de croissance des nerfs mais aussi, malheureusement, des virus neurotropes (Herpésvirus, peut être Poliovirus).

I-3-4 Mise en évidence de la fixation d'iode sur la tyrosine

(Biosynthèse des hormones thyroïdiennes, la communication hormonale)

Une peroxydase catalyse dans la glande thyroïde l'oxydation des ions iodure en iode et la fixation d'iode sur la tyrosine, première étape de la biosynthèse des hormones thyroïdiennes.

On peut mettre en évidence expérimentalement cette propriété de la peroxydase :

Le système révélateur est constitué par un empois d'amidon coloré en bleu par l'eau iodée. En présence de peroxydase et de tyrosine, les ions iodure sont oxydés en iode qui se fixe à la tyrosine. L'iode lié à l'amidon est déplacé, et la coloration bleue disparaît.

Solutions

Empois d'amidon à 0.1 % : délayer 0.1 g d'amidon soluble dans 20 mL de tampon pH 6.2. Porter à ébullition 70 mL de tampon pH 6.2 et y verser goutte à goutte l'amidon tout en agitant. Laisser refroidir et compléter à 100 mL.

Solution de tyrosine : mélanger 0.1 g de tyrosine et 100 mL d'eau. Ajouter 150 µl de soude à 10 mmol.L-1 ou quatre gouttes de pipette Pasteur). Mélanger.

Mise en oeuvre pratique

Placer dans un tube à hémolyse 0.5 mL de solution d'amidon, 1 mL de solution de tyrosine, 1.5 mL de tampon et une goutte d'eau iodée. Mélanger. Verser 0.5 mL de solution de peroxydase et mélanger. En quelques minutes, la solution s'éclaircit puis se décolore : l'iode fixé sur l'amidon a été déplacé.

Avec un colorimètre, placer dans la cuve du colorimètre 0.5 mL de solution d'amidon, 1 mL de solution de tyrosine, 1.5 mL de tampon et une goutte d'eau iodée. Mélanger. Placer la cuve dans le colorimètre et injecter 0.5 mL de l'extrait enzymatique.
La figure 4 présente les résultats obtenus au colorimètre pour deux concentrations en tyrosine.

I-3-5 Principe de la diffusion en gel d'agarose d'une protéine

(Technique utilisée sous diverses formes : séparation de protéines, immunologie)

Matériel et solutions

En plus des solutions indiquées au I-3-1, boîte de pétri de 5 cm de diamètre, agarose, pipettes Pasteur.

Mise en oeuvre pratique

Verser 1 g d'agarose dans 100 mL de tampon phosphate pH 6.2. Porter à ébullition pour dissoudre l'agarose. Laisser refroidir jusqu'à environ 60°c et couler l'agarose dans les boîtes sur une épaisseur de 2 à 3 mm. Après refroidissement, creuser des puits à l'aide d'un perce-bouchon : six puits de 5 mm de diamètre le long d'un cercle concentrique au bord de la boîte à environ 1 cm du bord et régulièrement espacés ; un puit central de 8 mm de diamètre. Enlever les pastilles de gel avec une pince à bouts aplatis. Remplir les puits périphériques avec un mélange volume à volume de méthoxyphénol à 1 g.L-1 et de peroxyde d'hydrogène à 10 volumes dilué au 1/100. Remplir le puits central avec l'extrait enzymatique. Laisser migrer (1 à 2 heures). Lorsque les réactifs se rencontrent, il se forme une bande colorée dans la zone de confrontation.

On pourra ainsi illustrer à bon marché le principe de la technique d'Ouchterlony même si on ne dispose pas d'antigène et d'immunsérum.

II- TYROSINASE
   (monophénol,orthodiphénol : oxygène réductase)

C'est un groupe d'enzymes très répandues aussi bien dans le règne animal que végétal : tyrosine-oxydase, catéchol-oxydase, polyphénol-oxydase. Chez les animaux, elle est responsable de la synthèse de la mélanine et certaines mutations dans son gène conduisent à l'albinisme ; chez les végétaux elle est responsable du noircissement à l'air des fruits et légumes sans qu'on en connaisse exactement le rôle physiologique.

II-1 Extraction et conservation

La tyrosinase peut être aisément extraite de diverses sources végétales telles que la Pomme de Terre, la peau de Banane ou le champignon de Paris. C'est cette dernière source de loin la plus pratique en raison de l'abondance de l'enzyme et de l'absence de substances pectiques qui facilite la filtration.

Placer le matériel d'extraction au congélateur avant la manipulation pour éviter la formation de mélanine au cours de l'extraction. Celle-ci donne une teinte foncée à l'extrait enzymatique (qui n'est pas gênante si on n'utilise pas un colorimètre).

Couper en morceaux un pied de champignon très frais (bien blanc) après l'avoir lavé. Broyer les morceaux au mixer avec 50 mL d'eau distillée glacée. Filtrer avec du matériel froid et recueillir le filtrat dans un récipient posé dans la glace pilée. Répartir le filtrat en aliquotes dans des tubes à hémolyse et les congeler immédiatement. Chaque tube une fois décongelé permet la réalisation d'une demi-douzaine d'expériences. Si on dispose d'une centrifugeuse et/ou d'un filtre de Büchner, on pourra améliorer l'extraction en centrifugeant l'extrait après la filtration.

II-2 Mise en évidence de l'activité enzymatique

La tyrosinase est active sur de nombreux substrats mono ou polyphénoliques dont elle catalyse l'oxydation en prèsence de dioxygène : tyrosine (monophénol), dihydroxyphénylalanine ou DOPA (orthodiphénol), dihydroxybenzène ou pyrocatéchol (orthodiphénol), pyrogallol (triphénol).

In vivo, les réactions sont assez complexes comme, par exemple, celles qui mènent à la formation des mélanines et qui se déroulent dans les mélanocytes, les follicules pileux et la rétine :  

      Tyrosinase            Tyrosinase
Tyrosine ------O2-------> DOPA (incolore) ------O2-------> Dopaquinone (jaune)---O2-----> Leucodopachrome (incolore)
                      Polymérisation
---O2----> Dopachrome ------> Métabolites indoliques  (brun) ---------------> Mélanines (brun à noir)

La tyrosinase participe également au métabolisme des catécholamines par la première étape.

In vitro, il est plus pratique d'utiliser un autre substrat que la tyrosine : la réaction est beaucoup plus rapide et le résultat qui ne dépend plus de la polymérisation des métabolites indoliques est plus constant. On utilisera donc du dihydroxybenzène (pyrocatéchol) selon la réaction suivante :

                                  Tyrosinase
Dihydroxybenzène ---------
O2  -----------> O-benzoquinone
    (incolore)  

La réaction enzymatique peut être suivie avec un colorimètre (bleu ou vert) en raison du changement de couleur du substrat, mais également avec une électrode à oxygène puisqu'il y a consommation de dioxygène.

II-2-1- Etude colorimétrique

Le matériel d'ExAO utilisé dans cette expérience est le même que celui utilisé pour la peroxydase.

Solutions

solution de dihydroxy 1,2 benzène à 0.55 g.L-1 (5 mmol/l), solution de tyrosinase, tampon phosphate pH 6.2.

Mise en oeuvre pratique

Faire buller de l'air dans le tampon avant l'expérience pour que la concentration en dioxygène ne soit pas limitante. Placer 1.5 mL de solution de dihydroxybenzène et 1 mL de tampon dans la cuve du colorimètre pour le réglage du zéro. Ajouter 1 mL d'extrait enzymatique dans la cuve et bien mélanger. Placer la cuve dans le colorimètre et déclencher l'acquisition. Si toutes les solutions sont placées au préalable au bain-marie à 35°c, on accélérera notablement les mesures.

La figure 5 présente les résultats obtenus avec un extrait enzymatique simplement filtré et dilué au 1/2 pour deux concentrations différentes du substrat.

Il va de soi que l'étude de la tyrosinase peut être menée sans l'aide de l'informatique. Dans ce cas, on utilisera les mêmes concentrations que celles données ci-dessus, mais on opérera dans un tube à hémolyse placé au bain-marie à 35°C pour accélérer la réaction. Là encore, on pourra tester les effets du pH et de la température sur l'activité enzymatique.

II-2-2 Etude oxymétrique

Si on dispose de matériel d'ExAO mais pas de colorimètre, on peut très bien utiliser l'électrode à oxygène pour suivre la cinétique de la réaction enzymatique. Ceci présente l'avantage de montrer que le dioxygène est un des deux substrats de la réaction enzymatique.

Solutions

Les solutions sont les mêmes que pour l'étude colorimétrique. On y ajoutera une solution zéro pour l'étalonnage de l'oxymètre (Na2SO3 à saturation).

Mise en oeuvre pratique

Placer 0.5 mL de pyrocatéchol et 2.5 mL de tampon phosphate dans un bécher de 5 à 10 mL ou dans une boîte en plastique pour objectif de microscope. Faire buller doucement de l'air dans la solution par l'intermédiaire d'un cathéter relié à une pompe d'aquarium en faisant attention de ne pas faire déborder. Laisser buller une dizaine de minutes avant d'étalonner la sonde. L'électrode à oxygène étant extrêmement sensible, il faudra utiliser une amplification modérée de l'électrode (amplification sur 4.5 avec le module oxymétrique d'Orphy-GTS). Tremper la sonde dans la solution zéro et régler le décalage pour être à une valeur voisine de 0. Mettre la sonde dans l'enceinte de mesure et laisser remonter à une valeur proche du maximum. Jouer éventuellement sur l'amplification pour cela.

Arrêter le bullage et attendre que l'électrode se stabilise.

Déposer goutte à goutte l'enzyme le long de la paroi du flacon, lentement, pour ne pas provoquer de turbulences et déclencher l'enregistrement.

La figure 6 (non disponible) présente le résultat obtenu dans ces conditions pour trois concentrations différentes du substrat.

II-3 Applications pédagogiques

L'étude de cette enzyme peut également servir de support pratique pour différents points des programmes des lycées.

II-3-1 Etude expérimentale de l'activité enzymatique (ExAO)

(Les enzymes, agents de catalyse. Voir I-3)

II-3-2 Une application en génétique : "un gène, une enzyme"

(Génétique humaine, génétique des haploïdes)

Etant donné l'implication du gène de la tyrosinase dans l'apparition de l'albinisme, il est intéressant de montrer que l'inactivation de cette enzyme ne conduit plus à la formation de produits colorés. On pourra donc faire deux réactions en parallèle, pas nécessairement avec un colorimètre, après avoir porté un échantillon d'enzyme à ébullition.

En terminale S où l'étude de la génétique des haploïdes est prévue, il est intéressant de compléter une séance de TP sur la préréduction et la postréduction chez Sordaria macrospora avec ce type de manipulation pour montrer que si la cible d'une mutation qui conduit à des spores claires est le gène, son expression phénotypique est due à une tyrosinase inactive. Il n'est pas mauvais, en effet, de souligner les relations entre niveau moléculaire et aspect visible de l'organisme.

III- ACETYLCHOLINESTERASE (acétylcholine-acétylhydrolase)

L'acétylcholinestérase est une enzyme très courante chez les animaux, notamment au niveau des synapses cholinergiques où elle inactive l'acétylcholine libérée dans la fente synaptique et permet ainsi la recapture de la choline par la terminaison synaptique. Dans les synapses du système nerveux central elle est liée à la membrane postsynaptique alors que dans les synapses neuromusculaires elle est liée à la lame basale qui s'étend entre membranes pré et postsynaptiques. Cette dernière caractéristique facilite son extraction. Enfin, elle est également présente dans le sérum sanguin et on peut mettre en évidence son activité en utilisant directement du sérum à la place de l'extrait enzymatique.

III-1 Extraction et conservation

L'enzyme est extraite des muscles de Ver de terre, invertébré facile à se procurer et qui peut être conservé des années en élevage continu.

Placer tout le matériel d'extraction au congélateur ainsi qu'un flacon d'eau distillée.

Prendre deux ou trois Vers de terre et les placer sur un bac à glace retourné pour les engourdir. Dès qu'ils ne bougent pratiquement plus, couper la tête et la queue à 1 cm de l'extrémité. Faire une incision médioventrale tout le long du corps pour l'ouvrir entièrement. Supprimer soigneusement tous les organes internes pour ne conserver que la paroi du corps bien rincée à l'eau froide.

Broyer les prélèvements, soit dans un mixer, soit dans un mortier avec du sable de Fontainebleau. Dans les deux cas, les récipients doivent être glacés. Ajouter 25 mL d'eau glacée pendant le broyage. Filtrer et recueillir le filtrat dans un récipient maintenu dans la glace. Centrifuger éventuellement et congeler immédiatement des aliquotes de l'extrait dans des tubes à hémolyse .

III-2 Mise en évidence de l'activité enzymatique

L'acétylcholinestérase (AChase) catalyse la réaction d'hydrolyse de l'acétylcholine en choline et acide éthanoïque (acétique) selon l'équation suivante : 

Acétylcholinestérase
CH3COOCH2CH2N+(CH3)3 + H2O -------------> CH3COOH + HOCH2CH2N+(CH3)3
Acétylcholine  Choline

Elle est spécifique des esters de l'acide acétique et si, physiologiquement, son substrat est l'acétylcholine, elle catalyse également l'hydrolyse de la butyrylcholine, de la butyrylthiocholine ou de l'acétylthiocholine selon la réaction suivante :

                                                  AChase
        Acétylthiocholine + H2O ----------------> Acide acétique + Thiocholine.

Les thiols réagissent avec le 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoate) ou DTNB en donnant un produit coloré en jaune selon l'équation suivante :

       Thiocholine + DTNB ---> 5-thio-2-nitrobenzoate + 2-nitrobenzoate-mercaptothiocholine (jaune)
                 Incolore  

Cette propriété rend possible l'étude de l'enzyme par photocolorimétrie en utilisant comme substrat de l'acétylthiocholine. D'autre part, la libération d'acide acétique permet de suivre la réaction enzymatique soit par pHmétrie, soit à l'aide d'un indicateur de pH. On dispose ainsi de trois méthodes différentes pour suivre l'activité enzymatique. La technique colorimétrique avec l'acétylthiocholine est toutefois la plus sensible et la plus rapide.

III-2-1 Etude colorimétrique (ExAO)

Matériel (Voir I-2)

Solutions

Tampon phosphate pH 7.4 (Voir I-3-1 pour la composition des solutions). Mélanger 800 mL de phosphate disodique et 200 mL de phosphate monopotassique pour obtenir 1 l de tampon.

DTNB Faire une solution de DTNB à 0.23 mmol/l dans le tampon pH 7.5 soit 0.1 g de DTNB par litre de tampon.

Iodure d'acétylthiocholine (IATC) Faire une solution contenant de l'iodure d'acétylthiocholine à 7 mmol/l, du NaCl à 0.15 mol/l dans le tampon pH 7.4 soit 2 g d'acétythiocholine et 8.7 g de NaCl par litre de tampon.

Enzyme : Extrait enzymatique de muscle de Ver de terre ou sérum de mammifère (se conserve indéfiniment au congélateur).

Mise en oeuvre pratique

Choisir la longueur d'onde correspondant au bleu (470 nm). Placer dans la cuve du colorimètre : 0.3 mL d'IATC et 2.5 mL de DTNB. Injecter 0.5 mL d'enzyme et déclencher les mesures. Avec cette technique, une durée de quelques minutes est suffisante. La figure 7 présente les résultats obtenus avec trois concentrations différentes en enzyme.

Celles-ci ont été réalisées en complétant à 0.5 mL avec du tampopn pH 7.5 des volumes d'extrait enzymatique de 0.1, 0.2 et 0.5 mL. On a également superposé sur le graphique la cinétique obtenue en présence de physostigmine à 10 mg.L-1 (tracé inférieur). Les différentes manipulations présentées pour la peroxydase sont également envisageables, mais outre que la préparation de l'enzyme est un peu plus délicate, le prix des réactifs utilisés pour l'AChase est plus élevé.

III-2-3 Etude pHmétrique (ExAO ou pHmètre)

L'étude pHmétrique nécessite moins de produits que l'étude colorimétrique mais elle demande un peu plus de temps (15 à 20 mn par expérience). Elle est utile lorsqu'on ne dispose pas d'un colorimètre et peut être également menée sans matériel d'ExAO.

Matériel

Les résultats présentés à la figure 8 ont été obtenus avec une sonde pHmétrique reliée à un boîtier d'amplification (Micrelec) mais tout pHmètre de sensibilité égale à 0.1 unité pH peut convenir pour cette expérience. Il faudra alors relever les valeurs au cours du temps pour construire manuellement les courbes.

Solutions

Chlorure d'acétylcholine Solution à 100 mmol.L-1 dans l'eau distillée soit 18 g.L-1.

Chlorure de sodium Solution à 100 mmol.L-1 dans l'eau distillée soit 5.85 g.L-1.

Mise en oeuvre pratique

Etalonner le pH mètre en utilisant des solutions tampon de pH 5 et 7. Jouer sur les boutons d'amplification et de décalage pour que l'échelle se situe entre ces deux valeurs.

Placer dans un bécher de 20 mL : 1 mL de la solution de NaCl, 1 mL de la solution d'acétylcholine et 5 mL d'extrait enzymatique dilué. Agiter pour mélanger et placer la sonde dans le milieu. Déclencher les mesures. (Voir figure 8).

III-2-4 Suivi visuel de la réaction

Si on ne dispose ni de matériel d'ExAO, ni de pHmètre, le suivi de la réaction enzymatique reste possible à l'aide d'indicateurs de pH colorés. L'activité enzymatique pourra alors être évaluée en mesurant le temps nécessaire au virage de l'indicateur. On peut utiliser soit de la phénolphtaléine soit du rouge de phénol. Cependant, il faudra plus de temps pour obtenir les résultats.

Solutions

Voir III-2-3 et ajouter une solution de soude à 5 mmol/l et une solution de phénolphtaléine ou de rouge de phénol.

Mise en oeuvre pratique

Placer dans un tube à hémolyse : 0.5 mL d'acétylcholine, 1 goutte de phénolphtaléine, 0.5 mL d'extrait enzymatique, 2 gouttes de NaCl, 3 mL d'eau. Si la solution reste incolore, ajouter goutte à goutte la solution de soude jusqu'au virage de l'indicateur. Incuber et chronométrer le temps nécessaire pour obtenir la décoloration de la phénolphtaléine. Avec le rouge de phénol, procéder de la même manière pour obtenir une coloration pourpre au début de l'expérience. La solution passe du pourpre au jaune lorsque le milieu s'acidifie en raison de la libération d'acide acétique.

III-3 Applications pédagogiques

Dans le cadre de la transmission synaptique en terminale, si l'on pratique l'étude myographique de l'action de l'acétylcholine (voir Etude de la synapse neuromusculaire), il peut être intéressant de montrer la présence de l'acétylcholinestérase dans les extraits de muscles de Ver de terre. A cette occasion, on peut également montrer l'action in vitro d'un inhibiteur de cette enzyme comme l'ésérine (physostigmine). On réalisera pour cela une concentration finale de 1 à 10 mg.L-1 d'ésérine ou de "Prostigmine" (Roche) dans la cuve réactionnelle (figure 7). On pourra aborder ainsi la notion d'inhibition compétitive d'une enzyme.

On pourra aussi évoquer l'intérêt médical de la mesure de l'activité de cette enzyme pour la détection des empoisonnements aux pesticides organophosphorés et l'utilité de ses inhibiteurs dans le traitement de certaines myasthénies. L'usage de ces substances comme pesticides peut également être expliqué.

Enfin, l'utilisation de dérivés organophosphorés comme armes chimiques permettra de montrer comment la compréhension de mécanismes physiologiques peut être dévoyée dans un but de destruction massive.

Conclusion

Comme on le constate, l'exemple des trois enzymes présentées ici montre qu'il est possible d'élaborer de véritables séances de travaux pratiques susceptibles de motiver nos élèves tout en faisant passer des notions souvent complexes. L'introduction d'un chapitre dédié aux différents aspects de la catalyse enzymatique en première S ne doit pas nous faire oublier que la plupart des problèmes biologiques peuvent être abordés au lycée par le biais des enzymes qui illustrent particulièrement bien l'originalité de la structure et de la fonction des protéines et l'importance à la fois théorique et pratique de leur connaissance approfondie.

Bibliographie

Keesey J. Biochemica Information. Boehringer Mannheim Biochemicals, 1987
Loncle D. Génie enzymatique. Doin, 1992
Pelmont J. Enzymes. Presses Universitaires de Grenoble, 1989
Pol D. Notice d'utilisation du module Photocolor pour Orphy GTS. Mécacel Electronique, 1993

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