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LA BIOLUMINESCENCE DE LA LUCIOLE 
ET SON UTILISATION PRATIQUE AU LYCÉE
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Voir aussi : 
Infographie moléculaire : les molécules impliquées dans la bioluminescence de la luciole

Introduction

La bioluminescence, émission de lumière froide par des êtres vivants, est un phénomène très répandu dans la nature : plusieurs centaines de genres animaux et végétaux sont capables d'émettre de la lumière qu'ils utilisent selon les cas aux fonctions de relation, de nutrition ou de reproduction. Dans certains cas, son rôle exact n'a pas encore été déterminé.

Les programmes de lycée ne prévoient pas l'étude des modalités spécifiques par lesquelles se réalisent les grandes fonctions des êtres vivants mais s'attachent plutôt à leurs principes généraux de fonctionnement. Aussi, l'étude de la bioluminescence en tant que telle n'est pas prévue dans le second cycle et nous ne l'entreprendrons pas ici. Elle peut néanmoins constituer un outil extrêmement précieux pour aborder de façon pratique divers problèmes biologiques liés à des domaines variés comme l'expression génétique, l'enzymologie ou le métabolisme énergétique. L'utilisation de bactéries luminescentes rend également possibles des investigations d'un très grand intérêt.

Il est possible de se procurer chez les fournisseurs spécialisés les produits nécessaires pour réaliser la photogenèse biologique in vitro. Dans ces conditions, si l'on dispose d'un luminomètre, il sera possible de quantifier les résultats expérimentaux et d'étudier l'action de différents facteurs sur l'efficacité de l'émission lumineuse. Relié à une chaîne d'ExAO, un tel dispositif donnera accès aux capacités de traitement de l'information de l'ordinateur.

Le système bioluminescent le plus pratique à utiliser in vitro est celui de la luciole. Les produits sont d'un coût raisonnable et l'intensité lumineuse obtenue est suffisante pour qu'un luminomètre peu performant donne de bons résultats.

On se limitera ici à montrer l'intérêt du système bioluminescent de la luciole étudié in vitro, mais d'autres systèmes sont disponibles et pourront se révéler également très utiles pour aborder expérimentalement bien d'autres problèmes biologiques que ceux que nous allons examiner ici.


La bioluminescence est le résultat d'une série de réactions chimiques dont l'exposé nous permettra de saisir les implications pratiques de son utilisation.

I- La bioluminescence, une réaction enzymatique
 
La figure 1 présente les réactions chimiques responsables de la luminescence chez la luciole.

Réactions de bioluminescence
On remarquera qu'en dehors de l'enzyme, la luciférase, et du substrat principal, la luciférine, deux cofacteurs sont nécessaires : de l'adénosine triphosphate (ATP) et de l'oxygène gazeux.

L'intensité de la lumière émise dépend de la concentration des différentes espèces chimiques. Aussi, lorsque la concentration en ATP est limitante, on dispose d'un moyen simple et précis de dosage de l'ATP : la mesure de l'intensité lumineuse de la réaction permet de déterminer la concentration en ATP dans le milieu réactionnel.

De plus, puisqu'il s'agit d'une réaction enzymatique, il est possible d'étudier les caractéristiques de la catalyse enzymatique à l'aide d'un tel système : on peut notamment étudier la cinétique enzymatique en fonction de la concentration en enzyme et/ou de la concentration en substrat et étudier l'action de différentes conditions de milieu sur l'efficacité de la réaction.

Enfin, le gène de la luciférase de la luciole a été cloné en 1985. Il est maintenant utilisé couramment comme gène rapporteur pour vérifier la bonne insertion d'un autre gène : placé en tandem avec un autre gène, il confère la propriété de bioluminescence aux cellules qui ont intégré les deux gènes ce qui procure un moyen simple de discriminer les cellules transformées.

Bien d'autres applications ont été développées pour la recherche, l'industrie ou la médecine et sont maintenant utilisées en routine dans les laboratoires. Elles permettent notamment une alternative à l'utilisation de traceurs radioactifs toujours très délicats à manipuler.

Au lycée, il est assez facile de mener des expériences de bioluminescence pourvu que l'on dispose d'un luminomètre relié à un système d'ExAO. Les élèves sont en général très intéressés par cette manifestation originale et mal connue de l'activité des êtres vivants.

De quelle façon l'utilisation de la bioluminescence peut-elle être exploitée au lycée ? Nous présenterons ici quelques exemples d'utilisation de ce système dans le cadre de l'étude de la catalyse enzymatique et de l'énergétique cellulaire, deux chapitres du programme de première S. Comme on le verra, d'autres applications sont également envisageables.


II- Bioluminescence et enzymologie

 L'émission de lumière résultant d'une réaction enzymatique, sa mesure peut être mise à profit pour étudier les caractéristiques de la catalyse enzymatique. Il s'agit donc de réaliser la réaction de bioluminescence in vitro et de mesurer la lumière émise à l'aide d'un luminomètre relié à une interface d'acquisition de données.

Les produits (extrait de lanterne de luciole et ATP) sont obtenus chez Sigma. Le matériel d'ExAO est constitué d'un photocolorimètre utilisé en luminomètre, d'une interface pilotée par un logiciel généraliste et d'un ordinateur. Le matériel utilisé ici est celui de Micrelec, mais n'importe quelle interface peut être utilisée pourvu que l'on dispose d'un logiciel généraliste.

Réalisation pratique

L'extrait de lanterne de luciole est dissout dans l'eau distillée de façon à obtenir une concentration finale comprise entre 2.5 et 12.5 mg.mL-1 selon le rapport sensibilité/coût recherché : plus la dilution sera importante et moins la sensibilité sera élevée.

Une solution stock de Mg-ATP à 0.1 mg.mL-1 est réalisée en dissolvant 1 mg d'ATP et 40 mg de MgSO4 dans 10 mL d'eau.

L'interface est paramétrée à l'aide du logiciel de façon à enregistrer environ 200 points de mesure sur une durée de 60 à 90 secondes.

La cuve de mesure reçoit 1 mL de l'extrait de lanterne et elle est placée dans le lumiomètre après agitation pour assurer l'oxygénation du mélange. Le couvercle est fermé, et 1.5 mL de la solution d'ATP convenablement diluée est injecté dans la cuve après déclenchement de l'acquisition.

Résultats

La figure 2 montre les résultats obtenus de cette façon pour différentes concentrations en ATP (2 à 150 µg d'ATP dans la cuve).

Pour les concentrations élevées en ATP on observe un pic de luminescence fugace (quelques secondes) suivi d'une décroissance progressive de l'intensité lumineuse. Plus la concentration en ATP diminue et moins le pic est marqué.

Comme l'intensité lumineuse du pic dépend de la vitesse initiale de la réaction enzymatique, il est possible de réaliser la construction de la cinétique enzymatique dans différentes conditions (en fonction de la concentration en substrat ou en enzyme, en fonction du pH etc.).

Pour cela, on relève l'intensité maximale de luminescence (ici en % du maximum délivré par le capteur) obtenue pour chaque concentration en ATP et on construit un nouveau graphe en portant en abscisses les concentrations en substrat et en ordonnées l'intensité lumineuse. Les logiciels généralistes présentent, en général, ce type de fonctionnalité. On peut aussi utiliser un tableur.

La figure 3 montre la cinétique en fonction de la concentration en substrat sur laquelle a été superposée par logiciel la modélisation de l'équation de Michaëlis-Menten.

Il est intéressant de constater, d'une part, que la relation entre intensité lumineuse et concentration en ATP est linéaire dans la gamme des concentrations 0 à 150 µg.mL-1 ce qui autorise un dosage précis de l'ATP dans n'importe quel extrait tissulaire et que, d'autre part, l'ATP en excès (au delà de 500 µg.mL-1) exerce un effet inhibiteur sur la réaction enzymatique. C'est vraisemblablement par l'intermédiaire du pyrophosphate libéré lors de la phase initiale de la réaction que s'exerce l'inhibition.

Une autre réaction enzymatique peut être étudiée à l'aide du même système : c'est celle catalysée par la myokinase musculaire comme on le verra ci-dessous dans le paragraphe consacré à l'énergétique cellulaire.


III- Bioluminescence et énergétique cellulaire

 1- Dosage de l'ATP chez la levure et détermination du nombre de molécules d'ATP par cellule

La nécessité de l'ATP dans la réaction de bioluminescence permet son dosage dans différents tissus ou cellules dont on l'aura extrait. Ceci permet une approche plus pratique de cette molécule essentielle dont les élèves entendent parler tout au long de leur cursus sans jamais constater concrètement son existence.

On présentera ici succinctement les résultats obtenus avec la levure de bière en raison de l'utilisation possible de la méthode en première S tant dans le programme commun que dans l'option sciences expérimentales mais il faut noter que la même méthode est applicable à n'importe quel extrait tissulaire.

Une fois les principes de ce type de méthodologie connus des élèves, ils n'auront pas trop de difficultés à élaborer eux-mêmes le protocole expérimental à mettre en œuvre pour mesurer la concentration en ATP dans un tissu quelconque (muscle, foie, tissu nerveux etc.) ce qui permet de fructueuses investigations et d'intéressantes comparaisons entre tissus différents.

Réalisation pratique

Une gamme étalon d'ATP est préparée en restant dans la gamme de concentrations compatible avec la linéarité des résultats (2 à 150 µg d'ATP dans la cuve). C'est donc une nécessité d'établir la cinétique enzymatique préalablement au dosage de l'ATP. L'intensité de bioluminescence est mesurée avec la méthode précédente pour les diverses concentrations de la gamme étalon et la droite d'étalonnage, Intensité lumineuse = f [ATP], est construite à l'aide du logiciel. La figure 4 présente la droite d'étalonnage.

L'ATP est ensuite extrait d'une suspension de levures dont on aura au préalable déterminé la concentration en cellules à l'aide d'une lame à numération ou par étalement sur milieu de culture, techniques couramment mises en œuvre au cours de l'option sciences expérimentales en première S et donc connues des élèves.

La suspension de levures est lavée puis centrifugée. Remis en suspension dans quelques mL d'eau, le culot est porté à ébullition au four à micro-ondes avant d'être broyé avec une pincée de sable dans un mortier. Après broyage, 5 mL d'une solution de MgSO4 à 40 mg/mL sont ajoutés. Cette solution est portée à ébullition au four à micro-ondes jusqu'à réduction du volume à 1 à 2 mL.

NB Une meilleure extraction peut être obtenue à partir de protoplastes après un traitement enzymatique adéquat. Le protocole peut être trouvé dans Travaux pratiques de biologie des levures.

Après une dernière centrifugation, le surnageant est testé en présence de la même concentration en extrait de lanterne que celle utilisée pour la gamme étalon et l'intensité lumineuse est enregistrée.

En reportant le point expérimental sur la droite d'étalonnage, on déduit aisément la concentration en ATP dans l'extrait.

Connaissant la concentration en cellules dans l'extrait (après numération sur lame), il est facile d'en déduire la concentration en ATP par cellule et donc le nombre de molécules d'ATP par cellule.

Pour cela, la fonction curseur du logiciel est utilisée pour pointer sur l'intensité de luminescence mesurée et obtenir ainsi la concentration en ATP correspondante pour l'ensemble de la suspension cellulaire d'origine. Après division par le nombre de cellules, on obtient la concentration par cellule. En faisant la moyenne de plusieurs mesures, on obtient une valeur de quelques femtogramme (10-15 g), exactement 6.3 fg par cellule dans les mesures présentées ici, soit 6.9 millions de molécules d'ATP par cellule, données compatibles avec celles trouvées dans la littérature.


Il me semble que ce type d'activité et de calcul ne sont pas des activités triviales pour nos élèves : ils les conduisent à mesurer les ordres de grandeur mis en jeu aux niveaux cellulaire et moléculaire et à mobiliser leurs connaissances en chimie.

Si ce type de manipulation peut être intéressant dans le cadre de l'étude de l'énergétique cellulaire ou dans le cadre de l'option "levures", il peut être également utile lors de l'option consacrée à la physiologie musculaire appliquée au sport ou lors de l'étude des voies de régénération de l'ATP. Dans ces cas, on pourra se limiter à la mise en évidence ou au dosage de l'ATP dans des extraits musculaires mais on pourra aussi aller plus loin en étudiant une enzyme intervenant dans la régénération de l'ATP musculaire comme la myokinase.


2- Mise en évidence et étude de l'activité myokinase

Il se trouve que les extraits de lanterne de luciole contiennent également de l'adénylate kinase ou myokinase, enzyme catalysant la biosynthèse d'une molécule d'ATP à partir de deux molécules d'ADP. Dans ces conditions, il suffit d'ajouter à l'extrait une solution d'ADP convenablement dosée pour voir apparaître la luminescence. On peut alors en déduire le mode d'action de l'enzyme. En pratique, toutes les autres conditions restant les mêmes que celles exposées dans la première partie, on utilise des concentrations en ADP de 10 à 300 µg.mL-1

La figure 5 montre un exemple de résultats pour 5 concentrations en ADP (tracés 1 à 5). On a superposé le résultat obtenu avec une concentration en ATP de 100 µg/mL (tracé 6) pour mettre en évidence les différences de cinétique des deux réactions.

Ceci permet de comparer la cinétique de la luminescence obtenue avec l'ATP et l'ADP. Comme on le constate, on a utilisé ici une échelle des temps courte de façon à mettre en évidence la différence de réaction du système : dans le cas de l'ATP, le pic est extrêmement rapide (le maximum est atteint en 2 s) alors qu'avec l'ADP, le temps nécessaire à l'obtention du pic est plus long et la décroissance du phénomène est beaucoup plus lente ce qui traduit l'activité de l'enzyme et la formation d'ATP qui en résulte.

Il est parfaitement possible également de construire la cinétique enzymatique de la myokinase avec cette méthode pour l'exploiter lors de l'étude de la catalyse enzymatique.
La figure 6 présente la modélisation de l'équation de Michaelis-Menten construite avec les valeurs correspondant aux pic de luminescence obtenus pour des concentrations croissantes en ADP :


Conclusions

Les quelques expériences présentées ici sont un exemple de support pratique à l'introduction et à l'étude de notions réputées difficiles comme la bioénergétique ou l'enzymologie. L'ensemble des manipulations décrites ne posent aucun problème de mise en œuvre au lycée pour peu que l'on dispose du matériel adéquat. Nous les utilisons en routine dans notre lycée sans aucun problème.

Cependant, elles ne constituent pas une revue exhaustive des possibilités d'expérimentation et d'applications pédagogiques de la bioluminescence. En effet, à côté du système bioluminescent de la luciole pour lequel d'autres applications sont envisageables (rôle des réactions d'oxydo-réduction dans l'émission lumineuse, importance de l'excitation électronique, importance du dérivé adénylate pour l'activation de la réaction, toutes particularités biochimiques communes à d'autres phénomènes métaboliques), d'autres systèmes bioluminescents peuvent être utilisés in vitro ou in vivo. C'est en particulier le cas des bactéries luminescentes qui peuvent être cultivées au lycée et utilisées notamment dans le cadre d'études sur l'environnement (mesure de la population bactérienne par sa luminescence en présence de divers polluants) ou dont les extraits permettent diverses études in vitro sur les coenzymes impliqués dans les principaux processus métaboliques étudiés au lycée.
La simplicité de l'utilisation de ces systèmes biologiques devrait conduire au développement de leur utilisation au lycée.



INFORMATIONS PRATIQUES

Luminomètre : module Photocolor (Micrelec)
Interface : Orphy-GTS (Micrelec)
Logiciel d'acquisition : Regressi (Micrelec)
Extrait de lanterne de luciole, ATP, sel disodique, MgSO4-7H2O (Sigma)


Bibliographie
Bassot J. M., Photogenèse in Encyclopaedia Universalis, 1990
Champiat D. & Larpent J.P. Bio-chimiluminescence, Masson, 1993
Herring P. J. La luminescence des animaux, La Recherche, avril 1992
Pol D. Travaux Pratiques de Biologie, Bordas, 1994
Pol D. Travaux pratiques de biologie des levures, Ellipses, 1996
Prosser C.L. Neural and integrative Animal Physiology,Wiley-Liss, 1991
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