Préparation de protoplastes de levure

Protocole

1. Prélever dans un tube à centrifuger 2 mL d'une suspension de levure obtenue en ensemençant la veille un milieu liquide complet
2. Centrifuger 1 minute et jeter le surnageant.
3. Remettre le culot en suspension dans 2 mL de la solution de pré-traitement et incuber 10 minutes à 35°C.
4. Centrifuger brièvement et jeter le surnageant.
5. Remettre le culot en suspension dans 2 mL de tampon au sorbitol.
6. Centrifuger 1 minute et jeter le surnageant.
7. Mettre le culot en suspension dans 2 mL de tampon au sorbitol et ajouter 2 mL de solution d'enzyme (lyticase) à 5 000 U.mL^-1.

Incuber une dizaine de minutes et contrôler l'avancement de la destruction de la paroi au microscope.

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1. Solution de pré traitement

• Dissoudre dans 80 mL d’eau distillée :

• EDTA : 0,74 g
• Tris : 2,42 g

• Ajuster le pH à 7,8.

• Ajouter :

• b -mercaptoéthanol : 7,8 g
• Sorbitol : 21,8 g

• Compléter à 100 mL

1. Tampon phosphate citrate pH 5,8 :

 
• Mélanger 1 volume de solution de citrate de sodium à 4,7 g.L^-1 avec 1 volume de solution de dihydrogénophosphate de potassium à 10,8 g.L^-1.

Dissoudre 21,8 g.L^-1 de sorbitol dans le tampon phosphate citrate pour obtenir la solution pour protoplastes.

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