Fiche technique

Dosage de l'ADN (méthode à la diphénylamine)


Matériel

  • Solution d'ADN de concentration connue
  • Échantillon d'ADN
  • Tampon citrate (TC)
  • Réactif à la diphénylamine
  • Spectrophotomètre
Protocole
  1. Peser 15 mg d'ADN et préparer une solution stock à 3 mg/mL en dissolvant l'ADN dans 5 mL de TC. Cette solution servira à établir la droite d'étalonnage.
  2. Préparer une série de dilutions à partir de la solution stock d'ADN : pour cela, préparer une série de tubes contenant 2 mL de TC chacun. Pipeter 2 mL de la solution stock dans le tube 1, mélanger ; pipeter 2 mL du mélange du tube 1 dans le tube 2 et ainsi de suite. Éliminer 2 mL du dernier tube. On obtient une série de tubes contenant 1.5, 0.75, 0.375, etc. mg/mL d'ADN.
  3. Ajouter exactement 4 mL de réactif à la diphénylamine dans chaque tube (chacun doit contenir initialement 2 mL) et bien mélanger.
  4. Mettre une bille au sommet de chaque tube, les placer dans un bain marie bouillant et au bout de 10 minutes, les immerger immédiatement dans un bain de glace.
  5. Régler la longueur d'onde du spectrophotomètre à 650 nm et utiliser le TC pour le blanc. Mesurer l'absorbance de chacun des tubes de la gamme étalon.
  6. Tracer le graphique de l'absorbance en fonction de la concentration en ADN (droite d'étalonnage).
  7. Dissoudre l'ADN extrait dans 10 mL de TC. Faire des dilutions au 1/10, 1/100 et 1/1000 avec du TC. Mesurer l'absorbance des différentes dilutions et calculer la concentration de l'ADN dans l'échantillon. Utiliser la dilution qui donne une absorbance dans la plage 0.1 à 1.5.
Protocole d'extraction de l'ADN

Produits & réactifs

Acide acétique (MM 60.05)

L'acide acétique glacial est à 99.6% (p/v) soit 17.4 mol.L-1.
Pour obtenir une concentration de  1 mol.L-1, ajouter 57.5 ml d'acide acétique glacial à 900 mL d'eau distillée et compléter à un litre.
Pour obtenir une concentration de 0.05 mol.L-1, ajouter 2.87 mL à 900 ml d'eau et compléter à un litre.

Réactif à la diphénylamine

Dissoudre 500 mg de diphénylamine dans 49 mL d'acide acétique glacial. Ajouter 1 mL d'HCl concentré.

Tampon citrate (TC)

Solution stock (20 X)

Dissoudre 175 g de NaCl et 88 g de citrate de sodium dans 900 mL d'eau distillée. Ajuster le pH à 7 avec de l'HCl à 1 mol.L-1 et compléter à un litre.

Solution de travail (1 X)

Diluer un volume de la solution stock 20 X dans 19 volumes d'eau distillée.

NB Le réactif à la diphénylamine colore le désoxyribose en bleu et peut être utilisé pour sa détection qualitative.

La détection qualitative du phosphate peut être faite avec du réactif nitromolybdique qui donne un précipité jaune.

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Didier Pol © 2006 
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