Travaux pratiques
ÉLECTROPHORÈSE DE FRAGMENTS DE RESTRICTION D'ADN


Le découpage des molécules d'ADN par des enzymes de restriction (reconnaissant spécifiquement une petite séquence de nucléotides) et la séparation des fragments obtenus par électrophorèse sur gel constituent un puissant outil d'étude de l'ADN. Cette technique est également nécessaire à la mise en œuvre du Southern blot, une technique permettant de localiser les gènes au sein des molécules d'ADN. Outre l'accès à diverses informations, ces techniques rendent possibles toutes sortes d'interventions sur le génome depuis l'identification de gènes jusqu'à leur clonage.

Quelles informations peut-on tirer de la séparation des fragments d'ADN sur un gel d'électrophorèse ?

La mobilité électrophorétique des fragments d'ADN est inversement proportionnelle au logarithme décimal de leur taille. En utilisant des fragments d'ADN de taille connue (marqueurs de taille) pour charger un des puits du gel, on obtient un ensemble de bandes dont on mesure la distance de migration à partir du puits. On peut alors construire le diagramme représentant la distance de migration (en mm) des bandes en fonction du log10 de la longueur des fragments (en pb). La courbe étalon ainsi obtenue peut être utilisée ensuite pour déterminer graphiquement la taille en paires de bases de fragments de restriction en fonction de leur distance de migration.

Les produits de digestion de l'ADN du bactériophage lambda (un virus parasite de bactéries) ont été digérés par les enzymes EcoRI et Hind III. On se propose de déterminer la taille des fragments obtenus.

Protocole

- Pour le remplissage de chaque puits, mélanger 10 µL de colorant de charge avec 10 µL d ’ADN sur un morceau de parafilm (réaliser les dilutions de façon à obtenir de 0.1 à 1 µg d’ADN par puits ; les bandes sont plus fines mais moins intensément colorées pour les faibles concentrations et vice-versa).

Les échantillons sont prélevés avec une micropipette en changeant de cône à chaque prélèvement.

- Remplir quatre puits : 1- ADN entier ; 2- fragments obtenus par action de Hind III ; 3- fragments obtenus par action de EcoR I ; 4- fragments obtenus par action de EcoR I et Hind III).

- Placer le support avec le gel dans la cuve d'électrophorèse, puits du côté de la cathode (pôle noir).

- Recouvrir de tampon TBE (réutilisable plusieurs fois).

Commencer par remplir les deux réservoirs puis verser très lentement lorsque le tampon commence à recouvrir le gel. En cas de mouvement brusque, l’échantillon risque de se dissoudre dans le tampon.

- Fermer la cuve, brancher les fils et mettre sous tension.

- Laisser migrer jusqu’à ce que les tâches de bleu de bromophénol arrivent à 1 cm de l’extrémité du gel.

- Couper l’alimentation, débrancher les connections et récupérer le gel dans son support.

Attention au transport : le gel glisse très facilement de son support.

Révélation des bandes d’ADN

Attention, le gel doit être manipulé avec soin car il est très fragile.

- Plonger le gel dans la solution de coloration pendant 20 min.

- Récupérer le colorant (qui peut être réutilisé) et transférer le gel dans un cristallisoir rempli d’eau tiède. Changer l’eau de temps en temps. Autre possibilité : laisser couler un mince filet d’eau tiède sur le gel en veillant à ce que ce dernier ne sorte pas de son récipient et à ce qu’il ne se déchire pas (laisser couler l’eau très lentement, recouvrir le gel d’une grille éventuellement). Poursuivre jusqu’à décoloration du fond.

Selon la température de l’eau et sa vitesse de renouvellement, la décoloration du fond peut être plus ou moins complète et prendre de moins d’une heure à quelques heures.

- Les bandes d’ADN apparaissent en bleu foncé sur un fond bleu clair. Les résultats seront analysés à la séance suivante.

Comparer les bandes formées par l'ADN total du phage l et celles issues de traitements enzymatiques et justifier les différences de mobilité électrophorétiques et d'intensité de coloration.

Remplir le tableau ci-dessous en y inscrivant la distance de migration des fragments observés.
 

EcoR I 
Hind III
EcoR I + Hind III Marqueurs (les plus petits fragments ne sont pas toujours visibles)
   
21226
   
5148
   
4973
   
4268
   
3530
   
2027
   
1904
   
1584
   
1375
   
947
   
831
   
564
   
125

Construire le graphique exprimant le log10 de la taille en fonction de la distance de migration.

Déterminer à partir du graphique la taille des fragments produits par les deux enzymes et inscrire les résultats dans le tableau.

Sachant que les marqueurs utilisés sont issus d'une double digestion par EcoRI et HindIII, discuter les résultats observés.


Voir le matériel utilisé

Voir des gels d'électrophorèse d'ADN

Accéder au protocole détaillé


RETOUR AU SOMMAIRE

TOUS DROITS RESERVES
© 1998-2008 D. Pol
dpol#noos.fr
Emplacements des visiteurs de cette page

N'hésitez pas à faire connaître vos impressions, commentaires, suggestions etc