Nous savons que les organismes chlorophylliens sont autotrophes pour le carbone, c'est à dire capables de synthétiser des substances organiques à partir de substances minérales. Cette synthèse nécessitant la lumière comme source d'énergie s'appelle donc photosynthèse. Chez les organismes photosynthétiques, l'utilisation de l'énergie lumineuse est rendue possible par l'existence de pigments, molécules capables d'interagir spécifiquement avec certaines longueurs d'onde de la lumière. Cette propriété confère aux pigments une couleur déterminée due à l'absorption de certaines longueurs d'onde lorsqu'ils sont éclairés par de la lumière blanche.

Problèmes :
Quels pigments trouve-t-on chez les organismes chlorophylliens et comment interviennent-ils dans la photosynthèse ?

Pour résoudre le premier problème, les pigments seront extraits de divers organismes chlorophylliens puis séparés par chromatographie pour être identifiés.
Les solutions brutes de pigments serviront ensuite à mener une étude spectrophotométrique permettant d'établir leur spectre d'absorption qui sera ensuite utilisé pour aborder le second problème.

Extraction des pigments

Objectif : disposer de solutions des pigments extraits de divers échantillons végétaux pour en identifier les constituants et pour établir les spectres d'absorption correspondants.

Protocole :

Les différents extraits réalisés à partir d'une même espèce avec un même solvant seront réunis après mise en réserve d'un volume suffisant pour la chromatographie (1 à 2 mL suffisent amplement).

Séparation des pigments par chromatographie sur couche mince

Etre attentif aux précautions nécessaires au bon déroulement de la chromatographie.
Dès que le chromatogramme est sorti de la cuve, l'observer en lumière ultraviolette et noter les observations.

Enregistrement des résultats

Noter la position du front du solvant et de chacune des taches de pigment au crayon directement sur le chromatogramme. Coller le chromatogramme sur la feuille de compte rendu et indiquer le nom de l'espèce correspondant à votre échantillon.

Étude spectrophotométrique

L'étude spectrophotométrique des solutions de pigments sera menée en mesurant l'absorption des différentes longueurs d'onde de la lumière visible par les différentes solutions de pigments bruts. D'autre part, la même étude sera menée sur une solution de chlorophylles purifiées à partir d'un extrait brut des pigments d'épinard et sur une solution des pigments hydrosolubles (phycobilines) extraits de cyanobactéries.

Protocole

• Après paramétrage de l'interface d'acquisition, placer une cuvette contenant le solvant seul dans le logement du spectrophotomètre.
• Régler l'appareil sur 380 nm.
• Régler le zéro d'absorption puis enregistrer l'absorbance de l'échantillon en tapant la valeur de la longueur d'onde au clavier et en validant.
• Recommencer les mêmes opérations pour l'ensemble du spectre, de 380 nm à 700 nm, en faisant une mesure tous les 10 nm.

Une fois toutes les valeurs acquises, sauver le fichier et imprimer le graphique correspondant.

Refaire les mêmes mesures pour chaque échantillon et superposer les tracés correspondant aux différentes espèces étudiées.

Autres propriétés des pigments

Observer les solutions de pigments placées dans une cuve à faces parallèles, d'une part en lumière transmise et d'autre part en lumière réfléchie. Refaire l'observation en éclairant avec une lampe à ultraviolets. Noter vos observations.

Compte rendu

1. Calculer le Rf (distance parcourue par le solvant/distance parcourue par le pigment) et identifier chaque pigment en utilisant les indications fournies en classe. Inscrire les noms correspondant en face des taches.
2. Noter les informations tirées de l'analyse du spectre d'absorption de la solution de pigments bruts.
3. Noter les informations tirées de l'analyse du spectre d'absorption de chaque pigment individuel.
4. Les données spectrophotométriques sont-elles compatibles avec les informations tirées de la chromatographie des pigments ?
5. Comparer la composition en pigments des différents échantillons étudiés.
6. Dans quels domaines pourraient être utilisées les informations fournies par la comparaison de l'équipement pigmentaire de différentes espèces ? Justifier.
7. Les propriétés des molécules de pigments révélées par leur fluorescence sont-elles en accord avec les autres propriétés identifiées au cours de cette séance ?