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Chromatographie sur couche mince des acides aminé des protéines |
- Placer le solvant dans la cuve sur une hauteur de 2 cm et fermer hermétiquement (couvercle ou film étirable).
- Tirer un trait de crayon sur la cellulose de la plaque à 3 cm du bord et parallèlement à lui sans arracher le matériau et sans le toucher avec les doigts.
- Prendre le capillaire disposé dans le tube contenant l’échantillon à analyser, essuyer son extrémité avec un essuie-tout puis déposer une microgoutte sur le trait à 1 cm du bord latéral gauche de la plaque. Faire le dépôt rapidement et sans appuyer de façon à ce que la tache formée n’excède pas 2 mm de diamètre. Prendre soin de ne pas arracher la cellulose avec le capillaire.
- Procéder de la même manière pour chacune des 10 solutions d’acides aminés disposées dans les tubes en espaçant les gouttes d’environ 1 cm. Utiliser uniquement le capillaire placé dans le tube correspondant et sécher les taches si nécessaire.
- Faire un deuxième dépôt de l’hydrolysat à 1 cm du bord latéral droit de la plaque.
- Placer la plaque dans la cuve à chromatographie contenant le solvant de développement. Le solvant ne doit pas atteindre le trait de crayon et le flacon ne doit plus être manipulé. Fermer hermétiquement le flacon.
- Laisser le développement se poursuivre pendant 45 minutes.
- Sortir la plaque avec des pinces et la sécher avec un sèche-cheveux (air froid).
Révélation. Mettre des gants et un masque pour la révélation et manipuler les plaques à la pince. Pas de flamme (acétone). La ninhydrine est cancérogène : prendre les précautions d'usage.
Sous hotte, tremper la plaque rapidement dans le révélateur puis laisser évaporer l'essentiel du solvant sous la hotte.
Finir au sèche cheveux chauffant (ou placer à l'étuve à 80°C et surveiller pour ne pas "cuire" les plaques) jusqu'à apparition des tâches.
| Acides aminés | Symboles à 3 lettres | Symboles à une lettre | Acides aminés | Symboles à 3 lettres | Symboles à une lettre |
| Alanine | ala | A | Leucine | leu | L |
| Arginine | arg | R | Lysine | lys | K |
| Asparagine | asn | N | Méthionine | met | M |
| Acide aspartique | asp | D | Phénylalanine | phe | F |
| Cystéine | cys | C | Proline | pro | P |
| Glutamine | gln | Q | Sérine | ser | S |
| Acide glutamique | glu | E | Thréonine | thr | T |
| Glycine | gly | G | Tryptophane | trp | W |
| Histidine | his | H | Tyrosine | tyr | Y |
| Isoleucine | ile | I | Valine | val | V |
Chromatographie de dix-neufs acides aminés protéinogènes
H A K M C I V F D S G P R E N Y Q W T
Solvant : butanol, acide acétique, eau (70, 18, 12 ; v %)
Révélateur : ninhydrine
butanol, acide acétique, eau (70, 18, 12 ; v %)
-
Révélateur :
NB Le protocole indiqué ici s'applique à des plaques de cellulose sur support souple (papier d'aluminium).ninhydrine à 1% dans l'acétone.
Le dépôt est de meilleure qualité s'il est fait avec une micropipette calibrée (2 µL) plutôt qu'avec un capillaire. Changer de cône pour chaque acide aminé.
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Didier Pol © 2006 |
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