Fiche technique

EXTRACTION ET DOSAGE DE L'ATP CELLULAIRE

Extraction

  1. Prélever 2 mL de l'une des deux suspensions de levures (aérobiose ou anaérobiose) et les verser dans un tube à centrifuger.
  2. Centrifuger 1 minute et jeter le surnageant.
  3. Remettre le culot en suspension dans 2 mL de la solution de pré-traitement et incuber 10 minutes à 35°C.
  4. Centrifuger brièvement et jeter le surnageant.
  5. Remettre le culot en suspension dans 2 mL de tampon au sorbitol.
  6. Centrifuger 1 minute et jeter le surnageant.
  7. Mettre le culot en suspension dans 2 mL de tampon au sorbitol et ajouter 2 mL de solution d'enzyme (lyticase) à 5 000 U.mL-1.
  8. Incuber une dizaine de minutes et contrôler l'avancement de la destruction de la paroi au microscope.
  9. Centrifuger 1 minute et jeter le surnageant.
  10. Ajouter 3 mL d’eau distillée puis porter à ébullition au four à microondes.
  11. Centrifuger et récupérer le surnageant.
Dosage
  1. Prélever 200 µL de réactif bioluminescent (extrait de lanterne de luciole dans un tampon) dans une cuvette standard.
  2. Placer la cuvette dans le porte-cuve du luminomètre.
  3. Prélever 1 mL du surnageant obtenu lors de l'extraction, le placer dans un tube, l’agiter vigoureusement pour l’oxygéner puis l’aspirer dans une seringue.
  4. Déclencher la mesure, injecter le surnageant dans la cuvette déjà en place et fermer immédiatement le porte-cuve.
  5. Sauver les données et répéter les mesures pour deux ou trois échantillons.
  6. Faire la moyenne des mesures individuelles et collectives et déterminer la concentration en ATP dans les deux séries d'échantillons à partir de la droite d'étalonnage fournie.
  7. Accès à la composition des solutions

    Voir la droite d'étalonnage

    Voir le dispositif de mesure

    TOUS DROITS RÉSERVÉS
    Didier Pol © 2006 
    dpol#noos.fr
    Emplacements des visiteurs de cette page

    N'hésitez pas à faire connaître vos impressions, commentaires, suggestions etc