Travaux pratiques
                  CONSTITUTION CHIMIQUE DE L'ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN)

Objectif : extraire l'ADN d'un échantillon biologique dans le but de mener diverses observations et analyses.

Les expériences de clonage montrent que le noyau cellulaire contient toutes les informations nécessaires au développement et au fonctionnement d'un organisme. En outre, lors de la mitose, le contenu du noyau prend la forme de chromosomes dont l'acide désoxyribonucléique (ADN), est le constituant principal. Ces observations suggèrent que le support chimique de l'information génétique est l'ADN. Ce dernier peut être extrait et purifié à partir de n'importe quel type de cellules nucléées. Pour extraire l'ADN, on utilisera ici du thymus de veau car il est constitué de cellules jeunes dont le rapport nucléocytoplasmique est élevé. Le thymus est un organe lymphoïde qui régresse après la puberté. Celui du veau se trouve dans le commerce sous le nom de ris de veau.

I- Extraction et purification de l'ADN de thymus de veau
Protocole
1) Couper en petits morceaux environ 0.5 cm3 de thymus congelé sur une lame porte-objet.
2) Avec une lame de rasoir, finir de hacher l'échantillon le plus finement possible.
3) Transférer la bouillie dans un tube à hémolyse.
4) Ajouter 1 mL de tampon tris-EDTA pH 7.5 (tampon TE) et 100 µL de Dodécylsulfate de sodium (SDS) en utilisant une pipette de précision.
5) Continuer le broyage avec une baguette de verre directement dans le tube. Le milieu doit devenir légèrement visqueux.
6) Équilibrer soigneusement les tubes et centrifuger. La force centrifuge va séparer les constituants du mélange selon leur densité : les débris cellulaires s'accumulent au fond du tube en un culot, la solution contenant l'ADN dissous forme le surnageant.
7) Récupérer le surnageant avec une pipette Pasteur et le transférer dans un tube à hémolyse propre.
8) Ajouter 350 µL d'acétate de sodium froid et 2.5 mL d'éthanol conservé à - 20°C et agiter légèrement. L'ADN précipite sous forme d’un long filament.
9) Attraper le fil d'ADN avec l'extrémité d'une pipette Pasteur et l'enrouler dessus.
10) Remettre l’ADN en solution dans 1 mL de tampon TE dans un tube Eppendorf : la solution sera utilisée ultérieurement.



Utilité des différentes opérations et des substances chimiques utilisées :

- Solution tampon : limite les variations de pH du milieu ce qui évite la dénaturation de l'ADN.
- SDS (sodium dodécyl sulfate) : détergent qui rompt les couches de lipides.
- EDTA (éthylène diamine tétraacétate) : chélateur des ions calcium. Les ions Ca2+ sont nécessaires à l'activité des DNases, enzymes qui détruisent l'ADN et sont présentes dans toutes les cellules.
- Centrifugation : séparation rapide des particules solides (les plus lourdes) des substances en solution (moins lourdes).
- Acétate de sodium froid et éthanol glacé : insolubilisent l'ADN.



1. En quoi un rapport nucléocytoplasmique élevé constitue-t-il un avantage pour extraire l'ADN ?
2. Identifier les principes physicochimiques mis en œuvre pour extraire l'ADN des cellules et le séparer des autres constituants chimiques cellulaires.
3. Justifier les traitements utilisés dans ce but en utilisant les informations données.

II- Les éléments de construction de l’ADN

Lorsque l’ADN est soumis à une hydrolyse ménagée, c’est à dire progressive, on obtient d’abord un mélange de molécules appelées nucléotides. Il existe 4 types de nucléotides différents, l'ADN étant un polymère de nucléotides, un polynucléotide.
Lorsque l’on poursuit l’hydrolyse, on constate que les nucléotides sont scindés en un acide phosphorique et en un nucléoside. Il existe donc aussi 4 types de nucléosides.
Enfin, si l’on poursuit l’hydrolyse, les nucléosides sont scindés en un sucre à 5 carbones, le désoxyribose et en une base azotée dont il existe 4 types dans l’ADN.

Un nucléotide, unité de construction de l’ADN comporte donc 3 sous-unités, molécules reliées par des liaisons covalentes :

  • une base azotée (il en existe 4 différentes dans l'ADN : Adénine, Guanine, Cytosine, Thymine).
  • un acide phosphorique
  • un sucre à cinq carbones, le désoxyribose
  • Les quatres bases azotées (image RASMOL) :

    Le ribose (le désoxyribose en diffère par l'absence de l'oxygène porté par le carbone 2) :
    (image RASMOL)
    L'acide phosphorique (image RASMOL) :

    Une base liée de façon covalente au désoxyribose constitue un nucléoside.

    Un nucléotide est donc un nucléoside monophosphate.

    Les nucléotides sont reliés entre eux par des liaisons covalentes en un polynucléotide.

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