Travaux pratiques
DIVERSITÉ DES PROTEINES CELLULAIRES.
PROTÉINES EXPORTÉES ET NON EXPORTÉES

Chez les organismes pluricellulaires (métazoaires), les cellules sont spécialisées et sont regroupées en organes. Par exemple, les cellules sécrétrices sont le plus souvent regroupées dans des glandes dont les produits de sécrétion sont utiles à l'organisme qui les contient. Il n'en est pas de même chez les organismes unicellulaires où chaque cellule doit assurer l'ensemble des fonctions. Ainsi, les cellules de la levure, Saccharomyces cerevisiae, sont capables d’utiliser divers sucres comme source de carbone, notamment des oses comme le glucose et le fructose et des diosides comme le saccharose et le maltose. Pour être utilisables, les diosides doivent être hydrolysés en oses car seuls les oses peuvent être métabolisés directement (c'est à dire sans transformation chimique préalable). Comme les levures peuvent vivre sur un milieu comportant soit du saccharose soit du maltose comme seule source de carbone, ceci suppose qu'elles synthétisent les protéines enzymatiques, saccharase et maltase et donc que leur génome comporte les gènes correspondants (sac+ et mal+ respectivement). Ces enzymes permettent en effet d'hydrolyser respectivement le saccharose en glucose et fructose et le maltose en glucose. Ainsi les génotypes sac+ et mal+ confèrent-ils repectivement aux souches de levures les phénotypes [sac+] ("capacité à utiliser le saccharose") et [mal+] ("capacité à utiliser le maltose") et donc à survivre sur un milieu comportant comme seule source de carbone organique du saccharose ou du maltose. Ces caractéristiques expliquent pourquoi les levures se développent facilement dans les milieux sucrés.

Problème 1 : comment identifier spécifiquement les protéines enzymatiques comme la saccharase et la maltase ?

Proposer les principes d'un protocole permettant la mise en évidence de la saccharase et de la maltase dans un prélèvement. (Les étapes du protocole doivent être réalisables selon des principes ou par des méthodes déjà mis en œuvre au cours de précédentes séances de TP). Écrire la formule semi développée du saccharose et du maltose.
Vous disposez de 20 minutes maximum pour remettre vos réponses à ces questions rédigées sur une feuille séparée. Dès que votre feuille sera ramassée, le polycopié correspondant à la suite de la séance vous sera remis et vous pourrez passer alors à la partie pratique de la séance.


Les oses sont directement utilisables par les cellules parce qu'ils peuvent diffuser du milieu extracellulaire vers le milieu intracellulaire à travers le plasmalemme. Il n'en est pas de même des diosides car la membrane cytoplasmique n'est pas perméable aux diosides. Un dioside donné ne peut donc être absorbé par une cellule que si sa membrane comporte une protéine spécifique, appelée transporteur membranaire, capable de transporter le dioside de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule. Toutefois, même en l'absence de transporteur pour un dioside donné, les cellules peuvent néanmoins l'utiliser si elles synthétisent et exportent dans le milieu l'enzyme permettant son hydrolyse. Ceci suppose que les cellules possèdent le(s) gène(s) correspondants.

Problème 2 : la levure dispose-t-elle de transporteurs membranaires pour le saccharose et/ou le maltose ou exporte-t-elle la saccharase et/ou la maltase dans le milieu extracellulaire ?

Pour résoudre ce problème, on cherchera à détecter la présence des deux enzymes, d’une part dans le milieu de culture (milieu extracellulaire) et, d’autre part, dans un extrait de cellules de levures (milieu intracellulaire).

Objectif : mettre en évidence la présence de protéines enzymatiques dans le milieu extracellulaire ou dans un extrait cellulaire pour déterminer si elles sont sécrétées ou non.

La fiche technique jointe présente une méthode permettant de déterminer si la saccharase et la maltase sont synthétisées et exportées par les cellules de levure. Mettre en œuvre le protocole et rédiger le compte rendu en répondant aux questions ci-dessous.

Compte rendu

Coller les bandelettes correspondantes dans l'emplacement approprié et remplir le tableau de résultats en indiquant + ou - selon le résultat du test.
 

Tubes
T1
Se
Me
T2
Si
Mi
Résultats
           

 
 
 
 

Bandelettes
 
 
 
 

 


 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 


 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 


 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 


 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 


 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 


 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 


 
  1. Expliquer en quoi un test positif permet d'identifier l’enzyme recherchée.
  2. Expliquer l'utilité des tubes témoins T1 et T2.
  3. Expliquer en quoi la sécrétion d'une enzyme hydrolysant un disaccharide permet de pallier l'absence de transporteur membranaire pour ce dioside.
  4. Analyser les résultats des expériences et en tirer les conclusions correspondant au problème 2.
  5. Le problème posé est-il entièrement résolu ? Justifier.
  6. Si le problème n'est pas entièrement résolu (c'est à dire si certaines conclusions ne sont pas directement prouvées), proposer les principes d'une ou plusieurs expériences permettant de le résoudre complètement.
  7. Écrire les équations-bilans des réactions enzymatiques qui se sont produites dans les tubes ayant présenté un résultat positif au test.

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