Travaux pratiques

MESURE DE LA VITESSE DE RÉACTION ET EFFET DE LA CONCENTRATION EN SUBSTRAT SUR LA VITESSE DE RÉACTION


On a pu constater à la première séance qu'en présence d’une enzyme appropriée, une réaction chimique donnée est considérablement accélérée. Ceci suppose un contact physique entre molécules réagissantes permettant la transformation chimique des substrats.

Problème

Comment se réalisent les interactions entre enzyme et substrats responsables de l’activité d’une enzyme ?

Nous avons déterminé un paramètre, la vitesse initiale, caractéristique de l’activité de l’enzyme.

Expliquer en quoi et dans quelles conditions elle permet de mesurer l’activité de l’enzyme, c’est à dire l’efficacité avec laquelle le substrat est transformé en produit.

Sachant que le substrat est consommé au cours de la réaction mais que l’enzyme reste inchangée, quel effet peut-on attendre d’une diminution de la concentration en substrat sur la vitesse initiale de réaction ? Justifiez.

Elaborer un protocole expérimental permettant de tester l’effet des variations de concentration en substrat sur la vitesse de réaction.

Après acceptation du protocole par le professeur, le réaliser en utilisant les indications pratiques de la fiche technique. Sauver les données et construire un nouveau graphique représentant Vi = f [S] à partir des mesures.

Décrire précisément le graphique : comment varie Vi lorsque [S] varie entre 0 et la concentration maximale testée ?

Déterminer graphiquement la vitesse maximale (Vmax) de la réaction dans ces conditions ainsi que la concentration correspondant à la moitié de la vitesse maximale (Km).

Recherchez une explication à l’allure du graphique en termes d’interactions moléculaires entre enzyme et substrats.

A quelles propriétés des molécules correspondent respectivement Vmax et Km ?


Fiche technique
CINETIQUE DE LA PEROXYDASE

Les peroxydases sont des hémoprotéines qui catalysent l’oxydation de nombreux substrats par le peroxyde d’hydrogène (eau oxygénée) selon l’équation :

                  Peroxydase

H2O2 + RH2 --------> 2 H2O + R

L’enzyme est spécifique du peroxyde d’hydrogène comme accepteur d’hydrogène mais tolère divers substrats RH2 comme donneur d’hydrogène, notamment des dérivés phénoliques. Le méthoxyphénol (gaïacol) est pratique car incolore au départ, il prend rapidement une teinte brune absorbant la lumière dans le bleu ou le vert lorsqu’il est oxydé. Cette propriété rend possible l’étude de la cinétique enzymatique par photocolorimétrie.

Solutions : méthoxyphénol à 3.5 mmol.L-1, peroxyde d’hydrogène à 1.7 mmol.L-1, solution stock d’enzyme à 0.1 mg.mL-1, tampon phosphate pH 6.2

Etalonnage : choisir Etalonne, Manuel, 0......0 ; 100m.....100.

Protocole : réaliser les acquisitions dans un fichier à pages permettant d’automatiser les calculs ultérieurs. Différentes dilutions permettant d’obtenir des concentrations moindres seront réalisées avec le peroxyde. Initialement, 2 mL de peroxyde et 1 mL de méthoxyphénol sont placés dans la cuve pour l’étalonnage (100 % de transmission). Au temps To, l’acquisition est déclenchée immédiatement après l’injection de 0.5 mL de solution d’enzyme dans la cuve à travers l’orifice ménagé dans le couvercle.

Unités : pour simplifier les unités lors des acquisitions, on considérera la concentration initiale en peroxyde comme la concentration 100 (unités arbitraires). Les dilutions effectuées pour les acquisitions suivantes sont données dans le tableau ci-dessous :

 
Concentration  mL H2O2  mL eau mL gaïacol 
mL enzyme
100 2 0 1 0.5
75 1.5 0.5 0.5
50 1 1 1 0.5
25 0.5 1.5 1 0.5
10 0.2 1.8 1 0.5
0.1 1.9 0.5
0 2 1 0.5
Faire une acquisition pour chaque concentration en peroxyde après un rinçage soigneux de la cuve.

Sauver chaque mesure obtenue avec chaque concentration en peroxyde dans le fichier à pages.

Calculs : à l’issue des acquisitions, sauver le fichier sous un nom explicite (par exemple, PEROX) et calculer l’absorbance à partir des valeurs expérimentales données en % de transmission. Pour cela, choisir : Variable, Nouvelle, Fonction, nom de la variable : A, unités : abs, commentaire : pas de commentaire. Compléter alors la formule dans le bandeau noir : A=log(100/T).

Supprimer ensuite T (Variable, Supprime, T, Oui) et sauver ce nouveau fichier sous un nouveau nom (par exemple, PEROXABS).

Afficher la première page, choisir Calcul, Modélisation, Intervalle, Bornes. Délimiter la partie linéaire initiale en déplaçant le curseur sur le premier point et en validant puis en déplaçant le curseur sur le deuxième point du segment de droite et en validant de nouveau. Choisir Modèle, Fonction puis valider. Taper l’équation d’une droite sous la forme a*t+b et relever la vitesse initiale calculée. Faire de même pour toutes les concentrations testées. Les vitesses initiales mesurées sont alors utilisées de la façon indiquée ci-dessous pour générer un graphique secondaire exprimant la vitesse initiale en fonction de la concentration en peroxyde d’hydrogène (Vi = f [peroxyde]).

Vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat

Choisir Fichier, Nouveau. Variable 1 : C (pour concentration), unités : UA (unités arbitraires) ou µmol si vous calculez la concentration en peroxyde dans la cuve. Variable 2 : Vi, unités : UA/s ou µmol/s si vous avez calculé la concentration en peroxyde dans la cuve. Variable 3 : appuyer sur la touche Echap (ou esc).

Remplir le tableau de valeurs avec les valeurs calculées précédemment puis sauver le fichier sous un nouveau nom (par exemple, VITPEROX). Afficher alors le graphique correspondant qui servira de support à votre analyse (voir les questions de travail pour le compte rendu). Choisir dans Graphique, Options, pas de ligne (L) et taille des Points égale par exemple à 5 pour tenir compte de la marge d'erreur sur les mesures.
Pour évaluer la vitesse maximale, tenir compte du caractère asymptotique du tracé.


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