Travaux pratiques
QU'EST-CE QU'UNE PROTÉINE ?

Nous savons que les protéines (du grec protôs signifiant en premier) sont des macromolécules organiques qui jouent un rôle fondamental dans la vie des cellules, et donc des organismes, car elles constituent les " outils " moléculaires qui établissent et maintiennent l'organisation (structure) et le fonctionnement (physiologie) des cellules. En outre, elles reflètent l'identité biologique comme le montrent les résultats d'électrophorèse de divers échantillons biologiques.

Problème : quelle est la constitution chimique des protéines ?

Pour résoudre ce problème, les opérations suivantes sont menées successivement :

  1. Isolement d'une protéine à partir d'un échantillon biologique.
  2. Hydrolyse enzymatique (par une protéase) d'une protéine permettant de libérer les unités de construction.
  3. Séparation et identification des unités de construction.
  1. Justifier la procédure employée pour résoudre le problème posé.
  2. Sachant que toutes les protéines sont construites à partir de 20 unités de construction différentes seulement (les acides aminés), quel nouveau problème devra être résolu pour établir précisément la constitution moléculaire d'une protéine donnée ?
NB Pour mener l'isolement de la caséine et la chromatographie dans la même séance, il est nécessaire de commencer par la chromatographie.

I- Isolement de la caséine du lait

Objectifs : séparer la caséine des autres constituants du lait en appliquant des méthodes chimiques et en déterminer la concentration dans l'échantillon.

Le lait, aliment unique des jeunes mammifères contient l'ensemble des substances organiques nécessaires à la croissance du jeune organisme. Parmi ces substances, il y a notamment de nombreuses protéines qu'il est possible d'identifier après séparation par électrophorèse. L'une d'entre elles, la caséine, se trouve à une concentration élevée d'environ 35 g.L-1. La caséine sera extraite du lait et grossièrement purifiée en suivant le protocole indiqué sur la fiche technique.

Voir la fiche technique
  1. Peser précisément la caséine après séchage et déterminer sa concentration par litre de lait.
  2. Après collecte des résultats de chaque groupe et établissement de la moyenne, commenter les résultats obtenus.
  3. Calculer le rendement de votre extraction en prenant pour base une concentration théorique de caséine de 35 g.L-1.
II- Séparation et identification des acides aminés

Objectifs : déterminer les acides aminés constituant un polypeptide.

Pour déterminer quels sont les acides aminés constitutifs d'une protéine, on soumet la protéine à une hydrolyse puis on cherche à identifier les acides aminés qui la constituent après les avoir séparés. La méthode de séparation utilisée est la chromatographie sur couche mince (CCM) qui est adaptée à la séparation des petites molécules biologiques.

Dans cette méthode, l’échantillon est déposé sur une couche mince de cellulose dont une extrémité trempe dans un solvant approprié. Le solvant monte par capillarité à travers la cellulose et entraîne les acides aminés à des vitesses différentes en fonction de leur affinité pour le support de cellulose et pour le solvant. De cette manière, les acides aminés individuels se séparent progressivement. Cette phase est appelée développement du chromatogramme. Après la séparation, les tâches correspondant à chaque acide aminé sont révélées par un colorant spécifique.

Pour identifier les acides aminés, on compare l’emplacement des tâches formées par les acides aminés présents dans l’hydrolysat de la protéine étudiée avec l’emplacement des tâches formées par les 20 acides aminés protéinogènes lorsqu'ils sont soumis à la chromatographie dans les mêmes conditions.

Dans les tubes disposés dans le portoir se trouvent d’une part un hydrolysat d’un polypeptide (polymère d'acides aminés) de constitution chimique inconnue et, d’autre part, des solutions de 10 acides aminés choisis parmi les 20 acides aminés protéinogènes.

Réaliser la chromatographie de l'échantillon inconnu à côté de celle des dix acides aminés en suivant les indications de la fiche technique.

Voir la fiche technique
  1. Déterminer la nature des acides aminés constituant votre échantillon en comparant la position des tâches obtenues avec celle des tâches obtenues avec chacun des acides aminés purs.
  2. Quelles caractéristiques du polypeptide initial restent inconnues ? Justifier la réponse.

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