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  QUAND L'ELECTRICITE SE FAIT AIDE DE LABORATOIRE


La biologie a connu au cours de ce dernier quart de siècle une extraordinaire moisson de connaissances avec la compréhension, désormais très avancée, des mécanismes de fonctionnement du vivant au niveau moléculaire. Les développements de la biologie moléculaire et de ses applications les plus célèbres (génie génétique, séquençage du génome ou encore essais de thérapie génique commencés récemment) s'accélèrent de jour en jour. Ces extraordinaires avancées scientifiques n'auraient probablement pas pu se produire sans la mise au point d'une technique permettant de séparer des molécules très proches chimiquement.

Certes, la chromatographie existe depuis le début du siècle et ses perfectionnements en ont fait un remarquable outil d'analyse ayant conduit à des découvertes essentielles comme la détermination de la séquence des acides aminés des protéines. Elle ne permet cependant pas de séparer les différentes protéines d'un extrait cellulaire ou des fragments d'ADN de différentes longueurs, opérations indispensables pour pousser les investigations jusqu'au cœur du génome.

Or, les protéines et les acides nucléiques sont les molécules essentielles des êtres vivants : les protéines conditionnent la structure et le fonctionnement des cellules tandis que l'ADN est la mémoire génétique des êtres vivants et dirige la synthèse des protéines. Il était donc indispensable de pouvoir isoler telle ou telle protéine ou tel ou tel fragment d'ADN de façon à les caractériser, à les étudier et, éventuellement, à les manipuler.

C'est la convergence de multiples travaux en physique, en chimie et en biologie qui a conduit à la mise au point d'une technique de séparation particulièrement efficace désormais utilisée quotidiennement dans les laboratoires, l'électrophorèse.

Cette technique met à profit l'effet du courant électrique sur les molécules chargées présentes dans un mélange pour les séparer les unes des autres.

Le physicien William Gilbert (1544-1603), médecin de la reine Elisabeth puis du roi Jacques Ier d'Angleterre, réalisa les premières expériences d'électrostatique dont les lois ne seront pourtant formulées qu'à la fin du XVIIIème siècle par le physicien Charles de Coulomb (1736-1806).

Lorsque Alessandro Volta (1745-1827) invente la première pile électrique en 1800 on dispose dès lors d'une source portable d'électricité. André Marie Ampère (1775-1836) définit le courant et la tension (dont les unités sont respectivement l'Ampère et le Volt...) et établit en 1827 les lois de l'électrodynamique. Ainsi, au milieu du XIXème siècle, le terrain est défriché pour l'utilisation pratique de l'électricité.

En 1859, l'Allemand Georg Hermann Quincke (1834-1924) découvre que des particules colloïdales sont entraînées par le courant électrique, phénomène qu'il appelle cataphorèse. Un peu plus tard, Hermann von Helmoltz (1821-1894) met en évidence un phénomène similaire en milieu liquide, l'électroosmose. Des substances chargées présentes dans un liquide se déplacent vers l'électrode de polarité opposée lorsqu'elles sont soumises à un champ électrique.

C'est en 1892 que S.E. Linder et H. Picton imaginent la possibilité d'exploiter ce phénomène pour séparer des molécules de charges électriques différentes : des molécules portant plus de charges doivent migrer plus vite que celles en portant moins. Le biochimiste suédois Arne Tiselius (1902-1971) concrétisera cette idée en séparant les protéines contenues dans le sérum sanguin et dans le lait ce qui lui vaudra le prix Nobel de chimie en 1948.

Au début, la séparation des protéines se faisait en milieu liquide dans un tube en verre et le repérage des substances séparées était réalisé par des moyens optiques complexes. Rapidement, on simplifia la technique en remplaçant le liquide par une bande de papier filtre imprégné d'une solution tampon (solution permettant de limiter les variations d'acidité) maintenant constante la charge électrique des molécules. L'échantillon à analyser est déposé sur le papier dont les extrémités sont reliées aux pôles d'un générateur de courant continu. Il circule donc un courant à travers la bande de papier et les molécules du mélange à analyser sont entraînées le long du papier à des vitesses différentes en fonction de leur charge électrique globale. Les avantages de cette méthode très efficace se révélèrent rapidement : la quantité de produit nécessaire est très petite, des protéines ne différant que par un seul acide aminé peuvent être séparées, des méthodes enzymatiques et immunologiques permettent la révélation des substances avec une spécificité étroite et il est possible de quantifier les différentes fractions séparées. Tout cela avec une méthode relativement simple à mettre en œuvre. Ultérieurement, on améliorera petit à petit la technique : d'autres supports nettement plus performants seront introduits comme les gels d'amidon, d'agarose ou de polyacrylamide.

La puissance de cette technique et sa simplicité de mise en œuvre lui valurent un immense succès. Elle fut dès lors appliquée dans de multiples secteurs de la recherche biologique et aboutit à une impressionnante moisson de résultats. Première constatation fondamentale, l'existence d'un important polymorphisme biochimique chez toutes les espèces vivantes : de nombreuses protéines existent sous des formes légèrement différentes traduisant l'existence de gènes homologues appelés allèles. La distribution de ces allèles varie selon les populations (comme la distribution des différents groupes sanguins par exemple). Cette découverte conduisit à une autre constatation fondamentale : dans l'espèce humaine, n'importe qui peut être plus proche sur le plan biochimique (et donc également sur le plan génétique) d'un habitant des antipodes, quelle que soit la couleur de sa peau, que de son voisin de palier. La couleur de la peau est due à un petit nombre de gènes et ne permet donc pas de définir des races à elle seule : un donneur de sang ou d'organe peut être issu de n'importe quelle population humaine car la proximité génétique est définie par l'ensemble des gènes et non, uniquement, par ceux gouvernant la couleur de la peau. En bref, dans l'espèce humaine, la notion de race est dépourvue de sens contrairement à d'autres espèces chez lesquelles peuvent exister des races géographiques qui ne se mélangent pas.

Diverses applications médicales de l'électrophorèse furent également mises au point. On détecte et on étudie ainsi diverses maladies génétiques, notamment celles de l'hémoglobine, et certains dysfonctionnements immunitaires. De plus, de nombreux tests de laboratoire nécessitent le recours à l'électrophorèse. Les multiples opérations qui s'enchaînent dans la pratique de l’ingénierie génétique sont séparées par des étapes d'électrophorèse pour isoler les molécules utiles. De même, le décryptage du génome humain ne pourrait se faire sans le recours à cette technique permettant de comparer l'ADN de personnes différentes.
Autant dire qu'on trouve désormais des appareils d'électrophorèse dans tous les laboratoires de biologie depuis ceux de biologie moléculaire jusqu'à ceux s'occupant d'évolution.



EXPERIENCE

REALISONS UNE ELECTROPHORESE

Matériel nécessaire

Une barquette en plastique à plusieurs compartiments séparés du type de celles où sont conditionnés les biscuits d'apéritif (la distance entre les deux compartiments à utiliser doit être de l'ordre de 10 cm), un couvercle ou un plat transparent qui sera placé à l'envers au dessus du dispositif, une feuille de papier buvard, 2 comprimés d'aspirine effervescent, 2 morceaux de fil de cuivre (ou du papier d'aluminium roulé en fil), une source de courant continu : soit 10 piles de 4.5 V (ou 5 de 9 V) placées en série, soit un chargeur de batterie, soit une petite alimentation 9 à 12 V, 300 mA (comme celles utilisées dans divers appareils, baladeurs, calculettes, etc.), du fil électrique, un trombone, colorants alimentaires ou autres (encres). On utilisera des substances naturellement colorées pour ne pas avoir à les révéler après migration.

Comment procéder ?

Dissoudre 2 comprimés d'aspirine effervescent dans 100 mL d'eau pour réaliser la solution tampon. Remplir les 2 compartiments extrêmes de la boîte sur 2 cm de hauteur avec cette solution. Découper des bandes de papier buvard d'environ 2,5 cm de large. Leur longueur doit être telle que posées à cheval entre les 2 compartiments les plus éloignés, leurs extrémités trempent dans le tampon. Tremper chaque bande entièrement dans le tampon puis la placer entre 2 feuilles d'essuie-tout pour l'essorer. Placer chaque bande à cheval entre les 2 compartiments. Immerger chaque fil de cuivre dans un compartiment et le relier à un fil électrique.

Préparer un mélange de colorants à raison d'une goutte de chaque colorant choisi. Tremper le bout droit du trombone dans le mélange et déposer la microgoutte ainsi prélevée sur le buvard près de l'extrémité. Faire ainsi 2 ou 3 dépôts au même endroit perpendiculairement à l'axe de la bande. Relier alors le fil situé du côté du dépôt au pôle négatif de l'alimentation et celui situé du côté opposé au pôle positif. Mettre le couvercle et laisser migrer 2 à 4 heures selon le type d'alimentation utilisé. On pourra de toute façon suivre la séparation des colorants du mélange à l'œil nu et l'arrêter lorsqu'on l'estimera suffisante.




NB Une autre solution tampon plus efficace mais un peu plus compliquée à faire :

Dissoudre 2 g de bicarbonate de soude dans 270 mL d'eau déminéralisée. Dissoudre 1 g de carbonate disodique dans 100 mL d'eau déminéralisée. Prendre 30 mL de cette dernière solution et les mélanger aux 270 mL de la première pour obtenir 300 mL de solution tampon (carbonate et bicarbonate peuvent s'acheter chez le pharmacien).


Amusez-vous bien !

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