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DES INTERACTIONS MOLECULAIRES AU COEUR DES CELLULES

Les enzymes représentent les outils moléculaires que les cellules utilisent pour réaliser leurs multiples activités, c’est à dire la " vie " même. Ce sont toutes, (à l’exception notable des ribozymes, acides nucléiques présentant une activité catalytique), des protéines, c’est à dire des molécules codées par une partie de l’information génétique contenue dans l’ADN, par un gène. La nature et la variété des protéines fabriquées par une cellule sont donc des caractères génétiques et conditionnent la structure et les fonctions de cette dernière.

Parmi les diverses protéines, les enzymes assurent une fonction de catalyseurs. En présence d’une enzyme donnée, une ou plusieurs molécules spécifiques sont amenées à interagir et à subir des transformations chimiques déterminées. Il en résulte la formation de nouvelles substances pouvant à leur tour être transformées par d’autres enzymes. On appelle substrats les substances réagissantes et produits les substances formées.

Pour pouvoir agir sur ses substrats, une molécule d’enzyme doit d’abord se lier avec eux. Cette liaison s’établit avec une région de l’enzyme, appelée site actif, dont la configuration spatiale est complémentaire de celle des molécules de substrats. On utilise souvent l’image de la clef et de la serrure pour décrire cette complémentarité de forme assurant la spécificité. On appelle complexe enzyme substrats l’ensemble formé par la molécule d’enzyme et les molécules de substrats spécifiques fixées sur elle. Le rapprochement des substrats et les propriétés chimiques du site actif favorisent alors les interactions chimiques conduisant à la transformation des substrats en produits. Ces derniers se détachent ensuite de la molécule d’enzyme qui, n’ayant pas été modifiée par la réaction peut donc resservir immédiatement.

La vitesse avec laquelle les substrats se fixent à l’enzyme puis sont transformés et enfin libérés caractérise l’activité de l’enzyme. Elle est au minimum de quelques centaines de molécules de substrat par seconde pour une molécule d’enzyme moyennement efficace mais peut être beaucoup plus élevée. Lorsque la comparaison entre la vitesse d’une réaction en absence et en présence d’enzyme est possible, l’augmentation de la vitesse de réaction assurée par l’enzyme peut atteindre quelques milliards de fois.

Spécificité et efficacité sont donc les deux mamelles des enzymes !

Pour étudier une enzyme, on l’extrait, on la purifie autant que possible puis on la fait agir in vitro sur ses substrats pour mesurer la vitesse de réaction. Les résultats des cinétiques permettent de comprendre le comportement des enzymes.

Ainsi, quand la concentration en enzyme est fixe et très inférieure à celle des substrats, on observe que la vitesse de réaction est d’abord constante puis ralentit jusqu’à atteindre zéro. Ceci s’explique en considérant les complexes enzyme-substrat qui se forment à tout moment : tant que le substrat est en excès, toutes les molécules d’enzyme disponibles sont liées aux substrats et les transforment à vitesse constante appelée vitesse initiale (Vi). Lorsque les substrats s’épuisent, la probabilité de rencontre entre molécules d’enzyme et de substrats devient de plus en plus faible, de plus en plus de molécules d’enzyme restent inemployées et la vitesse de réaction mesurée diminue. Enfin, lorsqu’il n’y a plus de substrats, la vitesse devient nulle.

Aussi, la valeur de Vi pour des concentrations croissantes en substrat est nulle en absence de substrat, augmente linéairement avec l’augmentation de la concentration en substrat puis cesse progressivement d’augmenter en tendant vers un plateau, la vitesse maximale (Vmax). En effet, aux faibles concentrations, la probabilité de rencontre entre molécules d’enzyme et de substrats augmente proportionnellement à la concentration de ces derniers. Si on continue à augmenter la concentration en substrat, la probabilité de rencontre devient maximale, les molécules d’enzyme travaillent à leur capacité maximale et Vi est donc égale à Vmax. On qualifie pour cette raison le palier observé de plateau de saturation.

L’expérience présentée a pour but d’étudier la cinétique d’une enzyme omniprésente dans les cellules, la catalase et de construire le graphique correspondant.

EXPERIENCE

MESURE D’UNE CINETIQUE ENZYMATIQUE

Principe

La catalase décompose l’eau oxygénée (peroxyde d’hydrogène) en eau et oxygène selon la réaction :
2 H2O2 ¾Catalase® 2 H2O + O2

Elle protège ainsi nos cellules des peroxydes toxiques formés lors des réactions d’oxydation.

Des carrés de papier imprégnés de catalase vont être plongés dans des solutions d’eau oxygénée de concentrations variées. La formation de bulles d’oxygène va alors entraîner le papier vers la surface avec une vitesse proportionnelle à la quantité d’oxygène formé, expression de la vitesse initiale de la réaction.

Matériel nécessaire

Du foie frais (bœuf, porc, poulet etc..), un broyeur électrique, eau oxygénée, filtres à café, essuie-tout, entonnoir, coton, pinces à épiler, pots de yaourt vides, montre.

Préparation du matériel

Broyer environ 5 grammes de foie dans un quart de litre d’eau et filtrer sur un filtre à café. Filtrer une deuxième fois dans un entonnoir en plaçant un tampon de coton au fond de l’entonnoir. Le filtrat constitue l’extrait enzymatique.

Mélanger 100 mL d’eau oxygénée à 10 volumes avec 500 mL d’eau. C’est la solution stock de substrat.

Découper des carrés de 1 cm x 1 cm dans un filtre à café et les mettre à tremper pendant une minute dans l’extrait enzymatique. Les récupérer avec la pince, les poser sur un papier essuie-tout et les retourner après une minute.

Mesures

Placer dans un pot 100 mL de la solution stock d’eau oxygénée. Saisir un des carrés de papier avec la pince et le déposer rapidement au fond du pot. Chronométrer le temps nécessaire pour que le papier remonte et vienne flotter en surface (temps t, en secondes).

Recommencer la même opération avec des dilutions croissantes de la solution stock tout en conservant le même volume d’essai (90 mL d’eau oxygénée avec 10 mL d’eau, 80+20, 60+40, 40+60, 20+80, 10+90..., par exemple).

Ajuster éventuellement les dilutions en fonction de l’efficacité de l’extrait enzymatique qui peut varier assez largement.

Construire ensuite le graphique représentant la vitesse initiale (la vitesse correspond à l’inverse de t, soit 1/t) en fonction de la concentration en substrat (qui correspond à la fraction de peroxyde dans la solution soit 1, 0.9, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0.1, dans l’exemple précédent).

Si les manipulations et les mesures ont été faites correctement, on obtient un graphique caractéristique avec plateau de saturation. On peut alors déterminer graphiquement deux paramètres-clefs de l’enzyme : la Vmax (vitesse maximale)et le Km, concentration en substrat donnant une Vi égale à la moitié de Vmax. Le Km caractérise l’affinité de l’enzyme pour son substrat. Plus il est petit, plus l’enzyme est efficace puisqu’elle travaille au maximum même si le substrat est rare dans la cellule.


Amusez-vous bien !

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